液相色谱法测定饲料中维生素B1的含量

重现国标中关于饲料中维生素B₁的检测方法。

根据现有条件对国标方法做出合适的调整方案。

试样中维生素B₁经酸性提取液超声提取后，将过滤离心后的试样溶液注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分析，用紫外检测器检测，外标法计算维生素B₁的含量。

（一）实验材料：维生素预混合饲料（1#多维）

（二）试剂耗材：

除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为超纯水；乙二胺四乙酸二钠（EDTA），优级纯；庚烷磺酸钠（PICB₇）,优级纯；冰醋酸，优级纯；三乙酸，色谱纯；甲醇，色谱纯；乙醇溶液，25%（v/v）。

提取液：在已装入700mL去离子水的1000mL容量瓶中加入50mgEDTA，待全部溶解后，加入25mL冰醋酸，5mL三乙胺，用去离子水定容至刻度摇匀。取860mL上述溶液与140mL甲醇混合即得。

流动相：在已装入700mL去离子水的1000mL容量瓶中加入50mgEDTA，1.1g庚烷磺酸钠，待全部溶解后，加入25mL冰醋酸，5mL三乙胺，用去离子水定容至刻度摇匀。用冰乙酸和三乙胺调节pH值至3.40。取上述溶液860mL与140mL甲醇混合后，用0.45μm滤膜过滤，超声脱气，待用。

维生素B₁标准溶液

维生素B₁标准贮备液：准确称取维生素B₁（购自百灵威化学）0.0500g于100mL棕色容量瓶中，加乙醇溶液超声15min待溶液全部溶解后，用乙醇溶液定容至刻度。此溶液浓度为500μg/mL，置于4℃冰箱中保存3个月。

维生素B₁标准工作液：准确吸取2.00mL维生素标准贮备液（3.2.9.1）于50mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，该标准工作液的浓度为20μg/mL。

（三）仪器设备：

实验室常用玻璃仪器；电子pH计；超声波清洗器； 流动相过滤装置； 针头过滤器，0.45μm或0.22μm；LC3000增强型高效液相色谱仪（紫外检测器）；安捷伦高效液相色谱柱TC- C18(2)，4.6mm×250mm，5μm

（一）色谱条件确定

参照GB/T 14700-2002的方法，初始条件如下：

色谱柱：C18，3.9mm×150mm，5μm。因手头没有此类型色谱，故采用3.3.7所述色谱柱。

流动相：0.80mL/min，根据需要作出调整。

温度：25-28℃

进样体积：10μL，此体积改为20μL。

检测波长：246nm

（二）维生素B₁主峰确定

流速设置为1.0mL/min，温度设置为25℃，分别进一针标样空白和一针维生素B₁标准工作液。实验谱图见图1。

图1. 标样空白与维生素B₁标准谱图对比

17.38min附近只有标准品出峰，而空白在此刻没有峰，这说明此峰及为维生素B₁的峰，前面的大峰为溶剂峰。

（三）优化色谱柱温度

 在原始色谱条件的基础上，流速改为1.5mL/min，温度依次设置为25℃、28℃和30℃，其他条件不变。

三种方案的谱图叠加效果如图2。

图2. 不同温度下VB₁保留时间的变化

 如图2所示，在流速等其他条件不变的情况下，随着柱温的升高保留时间提前。但根据国标所述温度条件最高为28℃，故选用此温度确定为色谱柱温。

（四）流速的条件优化

 在压力允许的范围内（20MPa），尽量提高流速，实验考察1mL/min、1.5mL/min和1.7mL/min流速下的保留时间变化。

不同流速下实验谱图叠加如图3

图3. 不同流速下VB₁的保留时间变化

如图3所示，提高泵流速后，保留时间有大幅度减小，其中1.7mL/min流速下压力为19.13MPa，适合本样品分析，故选择此流速为最佳值。

（五）根据上述实验最终确定的色谱条件如下：

色谱柱：C18，4.6mm×250mm，5μm。

流速：1.70mL/min。

温度：28℃。

进样体积：20μL。

检测波长：246nm。

除另有说明外，以下实验均采用此色谱条件。

（六）重复性实验

实验条件同4.1.4。样品为VB₁标准工作液，n=4，测试系统重复性。

实验谱图及数据

图4. 系统重复性报告

 如上数据可以看出，保留时间重复性为0.02%，峰面积重复性为0.19%，符合系统要求。

（七）检测限实验

 本实验检测限的确定采用3倍基线噪声所对应的标准品浓度。

 实验所采用的样品为VB₁标准工作液稀释100倍，即200ppb。实验谱图及信息如图5所示。

图5. 定量检测限谱图

 如上图5所示，主峰两侧的噪声为0.071mV，柱峰峰高为0.432mV，故检测限为（0.071mV×2×0.2μg/mL）/0.432mV=0.0657μg/mL。

（八）线性范围测定

 按照3.2.9.2的方法配置浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、25μg/mL和30μg/mL的维生素B₁六种标准溶液，注入高效液相色谱仪分析。谱图及数据见图6和表1。

图6. 六种不同浓度的标准溶液色谱图叠加

表1.不同浓度标准溶液与峰面积对应关系

 根据以上谱图及数据结果，按照峰面积与浓度的对应关系，做出标准工作曲线，如图7所示。

图7.不同浓度VB₁标准溶液工作曲线

该工作曲线的线性方程为：y=25101.6x+11170.5，回归系数r=0.999696。线性范围良好，可用作样品的含量测定。

（九）加标回收率测定

 1、加标样品的配制方法

（1） 取四只100mL棕色容量瓶，编号为0、1、2和3。分别称取0.25g维生素预混饲料（1#多维）于各容量瓶中。向1、2和3号容量瓶中各加入一定量的维生素B₁标准品，使其浓度分别为10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL。

（2） 加入2/3体积的提取液，超声提取30min。

（3） 降至室温之后，加提取液至刻度，过滤，进样。

2、 外标法计算每组样品中维生素B₁的含量。

3、 回收率数据集结果如下表所示

表2. 不同标准加入量的回收率

（十）维生素预混合饲料中维生素B₁的含量测定

1、 标准工作液的配制如3.2.9.2。

2、试样制备

（1） 称取0.25g维生素预混合饲料于100mL棕色容量瓶中。

（2）提取方法如4.5.1所述。

3、向设置好参数的高效液相色谱仪中注入标准工作液和试样溶液20μL，记录色谱图，如图8.

图8. VB₁标准品与1#多维样品谱图对比

4、外标法计算饲料中维生素B₁的含量为：9488μg/g

本实验根据国标方法做出改动，经优化的实验条件如上所述。该方法的定量重复性为0.19%；检测限为0.0657μg/mL；在5μg/mL至30μg/mL呈良好的线性关系，线性相关系数r=0.999696；回收率为98.63%-102.10%；外标法计算维生素B₁在预混饲料中的浓度为9488μg/g。