干货：单一剂量病毒颗粒估算

2021年1月，国家药典委员会和食品药品国际交流中心出版《治疗用生物制品病毒风险控制要点》。在药典新增章节《生物制品病毒安全控制》的基础上，对生物制品病毒安全控制的指导法规、过程检查与控制策略给出了更详细的解释，具有指导实际操作的价值。

 前期我们参与了《要点》部分章节的编写，并积极参与业内同行讨论。结合在病毒安全控制中的实践经验，我们陆续分享了几篇对《要点》的解读，希望能抛砖引玉，收获更多业内同行的真知灼见

实际工作中，我们常被问到：除了内源病毒，其他指示病毒应该如何计算？电镜检测不到病毒颗粒,该如何定量初始值？基因治疗产品如何评价病毒安全？等问题。在此，我们来先就“5.3.5每剂量病毒颗粒的估算”展开讨论。

其中，首要问题是：起始病毒颗粒数的定量方法。

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图1. 发酵液中类病毒颗粒数的电镜照片

以采用CHO细胞进行生物制品生产为例，评价培养料液（UPB）中病毒的起始量，是评估病毒安全性的“控制要点”。对于外源病毒的检测，无论是人源、猪源、牛源还是鼠源病毒，无论是in vivo、in vitro 还是特异性的PCR方法，都需要获得Negative的结论。

对于内源病毒而言，由于是CHO细胞天然携带内源性病毒的特征，通常会有Positive的定性结论，则需要通过电镜观察（图1）、逆转录酶活检测与感染性实验进行综合评估。其中，电镜观察法，一直是定量评价类病毒颗粒数的经典方法，被各国法规部门普遍接受，检测下限为~1x106 particles/ml，即6个log。

电镜计数的结果用于评价纯化工艺对于病毒清除能力。使用鼠白血病病毒(MuLV)作为指示病毒，来验证纯化工艺对内源病毒的清除能力。再结合纯化收率与设计剂量，可以计算出单一剂量的药物对应的病毒颗粒数。

如《要点》5.3.5示例中，单一剂量产品的病毒数为：<10-7.55particle/dose。ICH Q5A Appendix 5示例中，单一剂量产品的病毒数为：<10-6particle/dose。两个示例，都指出需要足够的病毒安全富裕量（Safety margin）。

在使用CHO细胞生产单抗的除病毒验证过程中，除代表内源病毒的小鼠白血病毒(MuLV)，还常常选择伪狂犬病毒（PRV）、呼肠孤病毒III型（Reo-III）和鼠细小病毒（MMV），来代表其他潜在各种病毒类型，“DNA/RNA、有/无包膜、颗粒大小、尤其对物理/化学处理明显耐受的病毒等”。

如何定量评价这几种指示病毒的Safety margin 呢？首要问题是如何定量UPB中除内源以外其他病毒的初始Log值。

除了内源病毒可以用电镜定量初始的Log值，所有外源病毒的检测都需要获得Negative的结论。对外源病毒的检测，通常需要将UPB样品与指示细胞共培养28天，通过对指示细胞的形态观察、血吸附实验或荧光抗体检测来判断检测终点。

虽然验证得到的检测下限一般为10×TCID50，但这种检查终点是指示细胞培养放大后的结果，无法对应到UPB的病毒颗粒log数。有业内同行用log1=0，作为非内源指示病毒的初始数量，以6~8个log作为总清除能力的目标，这也只是一种经验性判断。

CH Q5A Appendix 5与《要点》示例的计算方法，都适用于计算检测内源病毒所需的初始颗粒数。如何对其他非内源病毒的Safety margin进行计算，我们就一种定量UPB病毒初始含量的思路进行讨论。

问题又来了，Negative 的结论如何进行定量呢？这里分享我们的一种思路，可以参考电镜检查的Negative检测的处理方式。如果通过电镜检查，没有观察到类病毒颗粒，那就按照该方法的检测下限进行定量。

默克BioReliance®电镜方法检测下限为1.4x105 particles/ml，在没有检查病毒颗粒的情况下，计初始log值为6。

2020版《中国药典》，新增加了针对外源性鼠源性病毒3303的“荧光定量PCR法”，结合《药典》要求CHO细胞系需检查的MMV，我们整理了所需检测的八种病毒特征，汇总见附录表1，常用模型病毒的特征见附录表2。

默克BioReliance®针对CHO内源病毒Type C的qPCR（CHOp）的计量下限是1x103 particles/ml,也就是Negative 的结论对应于初始Log值为3，相比电镜检查的Negative 的定量水平更低。

如何将qPCR的检测下限，例如对Type C的检测下限20 copies/reaction 转变为log值，见以下的计算公式：

针对Type C类病毒颗粒的qPCR检测中，CHOp方法的检测下限为20 copies/reaction，提取的样品体积为130μL，洗脱体积为65μL，反应体积为5μL，每个Type C颗粒包含copy数为2。计算得出1000 particle/ml, Log值为3。

以qPCR检测鼠细小病毒MMV为例，用于检测UPB中MMV的qPCR方法，如检测下限为10 copies/reaction，提取的样品体积为280μL，洗脱体积为200μL，反应体积为5μL，每个MMV包含copy数为1。计算得出MMV的检测下限1429 particles/ml，log值为3.15。当检测结果为Negative，可以以3.15为起始病毒颗粒数log值，用来评估下游工艺的除病毒能力。

相对于MuLV ≥6个log初始值，3.15个log的MMV，并不会额外增加下游纯化的压力。

按照这种定量思路，可以拓展ICH Q5A Appendix 5与《要点》示例的计算方法，针对非内源病毒，“DNA/RNA、有/无包膜、颗粒大小、尤其对物理/化学处理明显耐受的病毒等”，都可以基于PCR方法Negative的检测结论，计算纯化工艺可以提供的Safety margin。

相比之前对非内源病毒Safety margin的评估，只能参考对MuLV清除能力，或参考经验值6~8log，基于qPCR的检测结论进行计算，其依据更为充分。

因此，默克BioReliance® Blazar™推出的PCR检测平台已经可以覆盖《中国药典》中示例的外源性病毒，并完全覆盖了ICH Q5所列出的MAP、HAP与RAP的目标病毒。

当生产细胞不产生内源病毒颗粒，如生产基因治疗载体的细胞系，也可以如法炮制，以qPCR方法对病毒的检测为基础，评价病毒安全的风险和纯化工艺带来的“safety margin”。

本篇解读，完全是基于技术问题的讨论，是对PCR技术应用的介绍，并不代表官方指导标准。希望能抛砖引玉，收获更多业内同行的真知灼见。

附录表1. 《药典》3303推荐采用PCR检测的8种病毒与MMV

附录表2. 针对CHO生物制品的模型病毒

编者简介

高飞 博士

2009年毕业于中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室。现任默克BioReliance®检测服务高级技术专家，为大中华区客户提供专业的技术法规咨询和项目实施方案。高飞博士拥有10年以上的专业经验，曾任知名外企下游团队经理，中国科学院过程工程研究所，副研究员。

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