维生素B12免疫亲和柱，它来了！

称取5-10g试样(精确至0.01g)，置于150mL具塞锥形瓶中，依次加入30mL 0.25mol/L乙酸钠缓冲液，0.05g淀粉酶，0.2g胃蛋白酶，2mL氰化钾(或氰化钠)溶液，充分混合。将样品溶液放入水浴恒温振荡器，在37℃，酶解30min (肉类样品酶解10~16h)，酶解后转入100℃水浴中，保持30min，取出冷却至室温。将样品溶液转移至100ｍL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。移取上述溶液40mL至50mL离心管中，在10000r/min下离心10min，取上清液用玻璃纤维滤纸过滤后备用。 

注：对于以氰钴铵素为营养强化剂，且本底中不含有其他形式钴胺素的样品，在样品提取时可不使用氰化钾(或氰化钠)。

ProElut VB12 IAC^* (Cat.#: 67123)

(1)上样：将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，弃去免疫亲和柱内的缓冲液，移取适量样品提取液 (其中含维生素B12为10~500ng) 注入玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以2mL/min(1-2滴/秒)流速缓慢通过免疫亲和柱，直至液面下降到亲和柱管体(未完全流干)。

(2)淋洗：10.0mL水淋洗，控制流速为2-3mL/min(1-2滴/秒)，弃去全部流出液，2~3mL空气通过免疫亲和柱抽干；

(3)洗脱：准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速控制为1~2mL/min(1滴/秒)，收集全部洗脱液于玻璃试管中；

(4)定容：50℃下氮气浓缩吹干后，初始流动相定容至0.5mL，供HPLC或LC-MS分析。

^* ProElut VB12 IAC维生素B12免疫亲和柱：采用柱状琼脂糖凝胶作为固相载体，琼脂糖凝胶与维生素B12抗体偶联形成免疫吸附剂，能够特异性的纯化样品中的维生素 B12。

分析条件

色谱柱：Diamonsil C18(2)  250x4.6mm，5μm (Cat.#: 99603)

流速：1.0mL/min

进样量：100μL

检测器：361nm

柱温：40℃

流动相：A：0.05%三氟乙酸 B：甲醇 梯度

注意事项

(1) ProElut VB12免疫亲和柱建议保存在2~8℃条件下，不能冷冻，保质期为18个月;

(2) ProElut VB12免疫亲和柱建议在室温(18~30℃)下使用;

(3) 样品净化过程中，样品过柱、淋洗、洗脱时，控制好流速，不能太快，否则会使检测结果偏低;

(4) ProElut VB12免疫亲和柱柱容量≤1000ng，当样品中维生素B12超过柱容量时，请适当减小上样体积；

(5) 本方法仅适用于食品中维生素 B12(氰钴胺)的检测，如需检测氰钴胺、甲钴胺、腺苷钴胺和羟钴胺总量，请参考其他方法进行样品前处理，然后再使用ProElut VB12免疫亲和柱进行净化。