【应用分享】动物组织中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮的残留检测

本方法（参考GB 31660.4-2019）适用于猪、牛、羊肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和牛奶中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的检测。

甲醇（CH3OH）、乙腈（CH3CN）、甲酸（HCOOH）、乙酸乙酯（C4H8O2）、正己烷（C6H14）、乙酸铵(CH3COONH4)、β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。

1.1溶液配制

• 80%乙腈水溶液：准确量取800mL乙腈和200mL水，超声震荡摇匀；

• 50%甲醇水溶液：准确量取50mL的甲醇，倒入100mL的容量瓶中，用水溶液定容至刻度，摇匀；

• 30%甲醇水溶液：准确量取30mL的甲醇，倒入100mL的容量瓶中，用水溶液定容至刻度，摇匀；

• 0.2mol/L乙酸铵水溶液：称取15.4g乙酸铵，用900mL水溶解，用乙酸调节pH=5.2后加水定容至1000mL；

• 0.1%甲酸水：取1mL的甲酸加入1000mL容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀。

2.1 样品酶解

取试样2g（准确到±20mg），于50mL离心管中， 加氘代醋酸甲地孕酮内标工作液40µL， 加0.2mol/L乙酸铵缓冲液4mL，涡旋混匀后加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40μL，于37℃下避光水浴低速振荡，酶解12h。

2.1.1 肌肉、肝脏、肾脏组织

试样经酶解后，加乙酸乙酯10mL，于旋涡振荡器上剧烈振荡10min，4000r/min离心5min，取上清液至梨形瓶中。残渣加乙酸乙酯10mL重复提取1次，合并上清液， 50℃旋转蒸发至干。加乙腈10mL、正己烷5mL使溶解，转至50mL离心管中，低速涡旋10s，3000r/min离心2min，弃正己烷层，下层液于50℃旋转蒸发至干，加30%甲醇水溶液3mL，溶解，备用。

2.1.2 脂肪组织

试样经酶解后， 加乙腈10mL， 于旋涡振荡器上剧烈振荡0.5min， 50 ℃超声提取10min，4000r/min离心5min，取上清液移至另一50mL离心管中。残渣加乙腈10mL重复提取1次。合并上清液，加正己烷4mL，低速涡旋10s， 3000r/min离心2min， 弃正己烷层。加正己烷4mL，再次除脂。下层50℃旋转蒸发至干， 加入30%甲醇水溶液3mL溶解，备用。

• SPE柱：SelectCore MCX固相萃取柱（60mg/3mL）

• 活化：依次用3mL的甲醇和水活化；

• 上样：加入提取好的全部上清液；

• 淋洗：依次用水、50%甲醇溶液各3mL进行淋洗，淋洗结束后再减压抽干；

• 洗脱：用5mL 甲醇溶液进行洗脱，洗脱液在50℃下用氮气吹干，用1.0mL乙腈（80%）-0.1%甲酸溶液复溶后过0.22μm有机滤膜，上机。

• 色谱柱：ChromCore C18 1.8μm，2.1×50mm

• 流动相：

  A）0.1%甲酸水溶液；

  B）乙腈

• 洗脱梯度：

• 柱温：30°C

• 进样体积：2μL

• 离子源: 电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI）负离子扫描

• 监测方式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）

• 电喷雾电压：4000V

• 干燥气：N2（11L/min，300℃）

• 雾化气压力：45psi

醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮属脂溶性化合物，难溶于水，易溶于有机溶剂，特别是在乙酸乙酯、氯仿、乙腈、二氯甲烷等有机溶剂中有较高的溶解度。本方法采用乙腈作为提取溶剂，提取液使用正己烷进行脱脂，过混合模式的强阳离子交换固相萃取柱，甲醇洗脱后氮气吹干，流动相复溶后过滤上液相色谱/串联质谱仪测定，试验发现该方法简便、快速、干扰少，是一种理想的检测方法。

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