小麦制品中呕吐毒素检测实验全解析

近期，食品药品监管部门食品安全监督抽查发现个别小麦粉产品脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，简称DON）超过标准限量值。

   脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称呕吐毒素，是由串珠镰刀菌、轮状镰刀菌以及多育镰刀菌等产生的真菌毒素，大多存在于小麦、大麦、玉米等谷物饲料中。在早期阶段，呕吐毒素能导致皮肤刺激、缺乏食欲、呕吐等；在后期，则会引起出血、消化道的坏疽、中枢神经系统问题，免疫系统的破坏，骨髓造血功能的减退以及脾和生殖功能减退等，对人类和动物健康造成极大的威胁。

   北京中检维康生物技术有限公司使用美国Vicam呕吐毒素免疫亲和柱参照GB/T23503-2009方法检测小麦中的呕吐毒素，并对其中注意点进行全面解析，给客户提供一个完整的解决方案如下：

一、实验原理

样品经过水提取、过滤、稀释，然后通过键合有呕吐毒素抗体的免疫亲和柱。此时，呕吐毒素被亲和柱中的抗体特异性吸附。用水或缓冲液将免疫亲和柱上的杂质出除去，然后用甲醇使抗体变性，从而将呕吐毒素从亲和柱上洗脱下来。最后，用HPLC进行定量检测。

二、样品前处理

称取25g磨细的样品，5g聚乙二醇；加入100mL纯水，高速均质提取2min，用玻璃微纤维滤纸过滤，取2mL滤液准备上柱净化。

三、样品的净化

u  将10mL注射器连接于免疫亲和柱上端

u  2mL上述滤液以1-2滴/秒的流速全部通过免疫亲和柱，弃掉流出的液体

u  以5mL水以同样流速淋洗一次，弃掉流出的液体

u  利用真空设备压入空气，确保排出所有液体

u  用1mL甲醇缓慢洗脱，残留的洗脱液使用真空设备抽出，收集洗脱液与干净试管中。

u  将洗脱液于50℃氮气下吹干，用0.5mL流动相定容，混匀，用于HPLC检测

四、液相条件

色谱柱：Cloversil-C18 4.6*150mm（5μm）或4.6*250mm（5μm）

流动相：甲醇:水 =2:8

流速：1mL/min

柱温：35℃

检测器：紫外检测器

波长：218nm

进样体积：50μL

        五、实验谱图

六、实验数据

七、注意事项

1.  样品添加回收试验时，标准品添加到样品中，静置2h后或过夜，再进行样品前处理，否则会出现回收率偏低的现象。

2.  不要随意更改操作步骤，如需更改和本公司技术部联系

3.  样品净化过程中，一定要控制好流速，不能过快，否则会出现结果偏低的现象

4.  如果将标准品直接过柱验证回收率时，一定要确保标准品上柱液中甲醇浓度不要超过5%

5.  实验中使用的玻璃仪器，一定要清洗干净，尤其是用次氯酸等处理过的仪器，否则会使结果偏低

6.  当用氮气氮吹时，氮气流不要过大，否则会损失部分呕吐毒素

八、试验中用到的耗材