2021-05-24 07:28:26 西安天隆科技有限公司
羽绒是指生长在鹅、鸭腹部呈芦花朵状的绒毛,是一种动物性蛋白质纤维,在羽绒、棉花、羊毛和蚕丝四大天然保暖材料中,羽绒的保暖性能最佳[1]。然而,目前市场上的羽绒制品价格高低悬殊,存在不少羽绒制品掺假造假现象[2-3],现阶段,羽绒市场存在用劣质原料冒充、标示的充绒量与实际不符、蓬松度不合格、清洁度不合格等问题[4],其中常见的用劣质原料冒充的方式有:用腈纶棉制成的假羽绒制品、用原毛制作羽绒制品、用粉碎绒(飞丝)制作的羽绒制品[5]。
在检测行业中,羽绒的鉴定主要依据国家标准gb/t 10288—2003《羽绒羽毛检验方法》及行业标准fz/t 80001—2002《水洗羽毛羽绒试验方法》提供的方法,该方法是通过光学显微镜,用肉眼观察样品的显微结构,并对比标准中关于鸭绒、鹅绒及其它鸟类绒毛显微特征的文字描述和图示进行归类鉴定。该方法对检验人员要求高、主观性大,容易产生误判,使用的示意图和文字描述简单,缺乏实物标样参照,给实际检验工作带来困难[6]。
有鉴于此,本研究开发了鸭绒及鹅绒制品的荧光pcr鉴定方法,以期与传统鉴定方法相结合,提高羽绒鉴定的客观性和准确度。
2 材料和方法
2.1 材料与试剂
2.1.1 试验材料
试验所用的鸭绒、鹅绒等制品来自市场购买。
2.1.2 试剂
异硫氰酸胍、聚乙烯基吡咯烷酮k-40(pvp k-40)、十二烷基硫酸钠(sds)、β-巯基乙醇为amersco公司产品,鲑精dna为sigma公司产品,taq酶及2×premix extaq酶购自宝生物工程(大连)有限公司,引物及探针(表1)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.2 方法
2.2.1 dna提取
挑取带毛囊的羽绒,剪取毛囊部位约0.03g样品,加入3ml 2% sds溶液[2% sds,50mmol/l tris·cl(ph值8.0),20mmol/l edta(ph值8.0)],65℃水浴1.5h,不时振荡;12000r/min离心5min,取上清;加入3ml羊毛提取液[4mol/l异硫氰酸胍,0.3mol/l氯化钠,4% pvpk-40,50mmol/l tris·cl(ph值8.0),20mmol/l edta(ph值8.0)]及60μlβ-巯基乙醇,65℃水浴4.5h,不时振荡;12000r/min离心5min,取上清,加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),颠倒混匀,12000r/min离心10min;取上清,加入1μl 10mg/ml鲑精dna,1/10体积的3mol/l乙酸钠(ph值5.2)及等体积异丙醇,-20℃沉淀过夜,12000r/min离心15min收集沉淀;小心倒去上清,用70%乙醇洗涤二次,风干;取50μl去离子水溶解沉淀。
2.2.2 荧光pcr检测体系建立
2.2.2.1 鸭绒、鹅绒特异性荧光引物设计
根据家鸭、番鸭、斑嘴鸭、家鹅、鸿雁、鸡、家鸽、鹌鹑、北美火鸡的线粒体12s rdna全基因序列设计引物和探针,在考虑引物及探针特异性的基础上,保证在引物和探针结合位点处,家鸭与其祖先种绿头鸭及斑嘴鸭序列一致,家鹅与其祖先种鸿雁序列一致。
2.2.2.2 荧光pcr扩增及结果判断
反应体系(20μl):2×premix ex taq 10μl,上下游引物各0.2μmol/l,探针为0.1μmol/l,模板dna为4μl。反应程序:95℃ 30s,95℃ 5s,60℃ 34s,40个循环。结果判断:ct值≤35时,可判定结果为阳性;ct值>35时,可判定结果为阴性。
2.2.2.3 方法特异性和检出限试验
以提取的家鸭、番鸭、鸭绒、鹅、鹅绒、鸡、鹌鹑、家牛、水牛、猪、绵羊、山羊、马、兔、小白鼠、鲑精dna为扩增模板,使用鸭绒、鹅绒特异性引物和探针进行荧光pcr反应,以验证方法的特异性;并以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的模板进行荧光pcr反应,以检测方法的检出限,每个梯度做三个平行。
2.2.3 样品检测
选取18个鸭绒制品,按1.2.1的步骤提取dna,按2.2.2进行荧光pcr反应,所使用的样品见表2。由于鹅绒制品较稀少,在市面上购买不到鹅绒制品,样品试验中不包含鹅绒制品。
3 结果
3.1 鸭绒及鹅绒制品dna提取方法的建立由于鸭绒及鹅绒制品含肉眼可见明显毛囊,试验中剪取鸭绒及鹅绒毛囊部位,使用sds-异硫氰酸胍-β-疏基乙醇法[7]提取鸭绒及鹅绒dna。所提取的dna浓度达20ng~200ng,进行荧光pcr反应时鸭绒dna及鹅绒dna的ct值分别为25和26(图1),表明使用该方法提取的dna质量满足荧光pcr要求。
3.2 方法特异性试验结果
结果,鸭绒特异性荧光引物仅能扩增家鸭、番鸭及鸭绒dna,与其它物种dna无非特异性扩增;鹅绒特异性荧光引物仅能扩增家鹅及鹅绒dna,与其它物种dna无非特异性扩增,表明所设计的引物特异性好。
3.3 方法检出限试验结果
结果,使用本方法提取100%鸭绒原料及100%鹅绒原料dna进行荧光pcr反应时dna检出限为10ng(含鲑精dna)。
3.4 样品检测试验结果
检测结果表明18个鸭绒样品均可检出鸭dna成分,未检出鹅dna成分,检测结果与产品的明示成分一致(表1)。单独使用家鸭特异性引物及番鸭特异性引物进行荧光pcr反应,18个样品均检出家鸭dna成分,未检出番鸭dna成分,表明18个鸭绒制品均来自家鸭绒。
4 讨论
动物纤维中的dna主要存在于毛囊部位,在毛干中也存有少量线粒体dna[8],由于羽绒制品含有肉眼可见的毛囊,试验过程中重点挑取毛囊部位,使用sds-异硫氢酸胍-β-巯基乙醇dna提取法[7]进行dna提取时,羽绒毛囊部位基本溶解,毛干产生大范围断裂,通过样品检测试验,表明该方法可成功提取鸭绒及鹅绒dna。
本试验选取线粒体16s rdna基因序列作为引物设计靶位点,引物设计时,必须考虑所设计的引物可涵盖全世界不同鸭鹅品系。理论上,由于鸭、鹅与其祖先种的分化时间久于鸭、鹅各品系分化时间,只要某段dna序列在鸭鹅及其祖先种中保守,则可保证在所有的驯化品系中保守,从而在理论上保证该引物可检测所有鸭鹅品系的羽绒制品。根据维基百科和相关文献的报道[9-10],除疣鼻栖鸭(cairina moschata,俗称番鸭)外,家鸭起源于河鸭属中的绿头野鸭(anas platyrhynchos)和斑嘴鸭(a. poecilorhyncha),而番鸭是由中南美洲引入的鸭种。家鹅是由雁类野鸟经人类长期驯化形成,其中中国家鹅由鸿雁(anser cygnoides)驯化而成,欧洲家鹅由灰雁(a.anser)驯化而成。因而,下载家鸭、番鸭、家鹅与其祖先种,同时下载相近品种进行引物设计,所设计的引物通过ncbi数据库blast比对以及特异性试验,表明特异性好。
羽绒纤维种类的鉴定目前主要依靠显微镜法,该方法操作简单,但过分依赖试验人员的素质和经验,主观性过强,本研究开发的方法可作为传统显微镜鉴定方法的有力辅助,进一步提高羽绒鉴定的客观性和准确性。
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