【食品应用】固相萃取-气质联用仪分析乳制品中三聚氰胺掺假

引言

2008年9月，中国乳制品中的三聚氰胺掺假和污染问题再一次成为世界关注的头条新闻。此次事件发生在宠物食品中三聚氰胺污染问题曝光之后的18个月后。在三聚氰胺事件中，最初采用气相色谱/质谱联用仪（GC/MS）可以成功地检测原料及成品中的三聚氰胺，此应用详细请见PerkinElmer应用文章“采用GCMS在蛋白质食品中三聚氰胺掺假的筛查应用”1。

在牛奶中三聚氰胺事件突发后，类似的检测方法也应用于婴儿配方奶粉和其它乳制品中。然而，与宠物食品相比，牛奶和乳制品中含有大量的脂肪和糖类。样品基质相差甚大，因此乳制品样品的前处理方法需改良。最主要是对样品提取液采用固相萃取（SPE）去除牛奶基质干扰。本文将提供详细的前处理改良方案，采用GCMS成功地分析乳制品中的三聚氰胺。同时，采用GCMS分析系统对改良前处理方法进行验证。

实验

牛奶和乳制品通常需要特定的样品前处理。在本文中采用的是将Sigma-Aldrich2的样品萃取方式和FDA3中提供的改良的衍生化反应和分析步骤相结合的分析方法。

三聚氰胺样品准备：在全脂牛奶中加入50 μg/mL（50:50 乙腈:水）的三聚氰胺标品，三聚氰胺最终浓度为1 μg/mL。

样品前处理过程如下：

1. 往5mL加标牛奶中加入5mL的100mM磷酸盐缓冲液(pH 2.5)和1 mL的乙腈

2. 水浴超声5分钟

3. 在3500rpm离心10min

4. 取上清液进行SPE萃取

5. 取2.2毫升的上清液（相当于1毫升的牛奶样品）用于SPE净化。

SPE萃取柱采用的是强阳离子交换柱，型号为Discovery®DSC-SCX (500 mg/6 mL, Sigma-Aldrich)。分离过程如下：

1. 使用前依次用3 mL甲醇和3mL0.1%甲酸平衡SPE萃取柱

2. 上样（2.2 mL）

3.依次用3 mL 0.1% 甲酸和3 mL甲醇淋洗SPE萃取柱

4. 用4 mL 5% 氨化甲醇溶液将三聚氰胺从SPE萃取柱洗脱下来

5. 取1mL洗脱液于进样瓶中，并置于50℃下用氮气(压力为5psi)吹干备用

6. 样品进行衍生化反应

三聚氰胺采用由双（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）和1%三甲基氯硅烷（TMCS）组成的Sylon-BFT衍生物试剂（Supelco®）衍生化为三甲基硅烷基（TMS）衍生化产物；取上述氮气吹干残留物的进样瓶中加入200μL吡啶和300μLSylon-BFT衍生化试剂，70˚C下反应45分钟。

衍生化后，供GCMS法定量检测或确证。本文中使用的GCMS系统为珀金埃尔默®Ecoanalytix™三聚氰胺分析仪，包括了®Clarus 600 GC / MS系统和仪器相关参数。详见表1和表2。

结果

过去采用GC／MS可以很容易地检测到0.1μg／ml的三聚氰胺，比食品中已建立的检测限2.5ppm还低了25倍1。早期的文献也曾报道分析方法的灵敏度在1ppb和10 ppb之间低浓度级别。图1展示了5ppb标品的信噪比（RSM）S/N大于25：1（备注：此结果是采用略有不同的气相色谱升温程序，从而使三聚氰胺峰在最后洗脱出来）。采用同一批次的牛奶进行加标测试，加标水平为1ppm，做8个平行样品。其中一个加标样品的色谱图见图2。采用1ppm的加标浓度验证SPE固相萃取法的精密度和回收率。结果表明，从加标样品中测得的三聚氰胺1ppm浓度的平均RMS值约为13700:1（n=8），该方法的灵敏度远远超过监管测试标准的要求。

此外，由8个平行加标样品的m/z 327+342提取的峰面积计算得到的精度可达3.45%RSD。这个数据也证明了前处理萃取方法和仪器运行方法均有很好的重现性。与0.5 μg/mL的标品（相当于加入牛奶样品中1 ppm）峰面积2.3 x 107相比，加标样品中的1ppm三聚氰胺平均峰面积可达到2.7 x107 。样品加标回收率约为120%。这个回收率在可接受范围内，不过个别文献2也报告过112%。

图1. 5ppb三聚氰胺标品提取离子为m/z 327+342的GCMS色谱图，展示了仪器灵敏度。

图2. 1ppm三聚氰胺加标样品提取离子为m/z 327+342的GCMS色谱图

结论

对于牛奶及乳制品中的三聚氰胺检测，需要使用SPE去除由样品基质带来的高脂肪和高糖分的影响。本文使用的方法包括强阳离子交换柱，SPE，衍生化和GC／MS分析方法，结果表明，乳制品中的三聚氰胺采用此方法可以成功地检测到远远低于法规规定的限量。

参考文献

1. “Screening for Melamine Adulteration in Protein-Based Foods by GC/MS” James Neal-Kababick, Flora Research Laboratories, William Goodman, PerkinElmer(007969A_01).

2. “The Extraction and Analysis of Melamine in Milk-Based Products using Discovery DSC-SCX SPE and Ascentis Express HILIC LC-MS/MS” Olga Shimelis, Carmen T.Santasania, and An Trinh. Sigma-Aldrich.

3. “GC-MS Method for Screening and Confirmation of Melamine and Related Analogs” V2 May 7, 2007 FDA LIB 4423 Jonathan J. Litzau, Gregory E. Mercer, Kevin J. Mulligan. Forensic Chemistry Center (FCC), Food and Drug Administration, 6751 Steger Drive, Cincinnati, OH 45237, Pacific Regional Laboratory Northwest (PRLNW), Food and Drug Administration, 22201 23rd Drive SE, Bothell, WA 98021.