瑞孚迪药筛有术：Envision超敏发光模块助力研究新发现！

2024-12-20 18:35:18, HJH 科瑞恩特（北京）科技有限公司

河马信号通路 (Hippo Signaling Pathway)，简称河马通路或Hippo通路，是一个在哺乳动物中相对保守的信号通路，其在组织生长、组织稳态(tissue homeostasis)、组织再生修复(regeneration) 等过程中起着重要作用 (Kim and Jho 2018) 。

Hippo通路首次发现于黑腹果蝇中，研究表明该通路基因突变（如Hpo，Sav，Wts突变）会使组织异常增生，导致果蝇出现一个巨大的头部，脖子上出现褶皱，形似河马，故因此而得名（图1）(Kango-Singh and Singh 2009)。

图1：Hippo通路基因突变引起果蝇头部异常增大

（a：野生型，b，c，d突变型）(Kango-Singh and Singh 2009)

Hippo通路核心成员包括一系列激酶和蛋白，如哺乳动物中的SMT1/2激酶，YAP/TAZ蛋白，当通路上游膜蛋白受体收到激活信号后，引起一系列激酶级联反应，然后磷酸化下游效应因子YAP/TAZ，继而与14-3-3α细胞骨架蛋白结合被滞留在胞质内，无法进入细胞核行使转录激活功能。相反，当通路未被激活时，YAP/TAZ不发生磷酸化，无法与14-3-3α细胞骨架蛋白结合，进而迁移到细胞核，与TEAD转录因子结合，激活下游基因的表达。这一激活/未激活的动态过程，实现了对细胞和组织器官大小的调控（图2）(Zhao, Tumaneng et al. 2011, Boopathy and Hong 2019)。

图2：Hippo信号通路示意图（果蝇和哺乳动物）(Zhao, Tumaneng et al. 2011)

为进一步了解TAZ与14-3-3α细胞骨架蛋白的相互作用，Andlovic等人设计了一种检测体系，可以在活细胞水平检测TAZ与14-3-3α的动态结合过程，并可用于高通量抑制剂化合物筛选(Andlovic, Wolf et al. 2024)。

该检测体系采用了基于微孔板检测仪的NanoLuc^®Binary Technology (NanoBiT^®) 实验技术。体系由一个LargeBiT (LgBiT) 和一个Small BiT (SmBiT) 蛋白亚基组成。单一的亚基没有酶催化活性，可分别与两个待测蛋白融合表达，若两个待测蛋白存在相互作用，则空间距离上会彼此靠近，并导致LgBiT 和 SmBiT亚基靠近，从而在结构上形成互补，形成具有催化活性的荧光素酶，加入底物后变会产生明亮的发光信号。☞NanoBiT^®Protein:Protein Interaction System Protocol

在该研究中，研究者将14-3-3蛋白和LgBit融合表达，TAZ和SmBit融合表达，之后共转染HEK293细胞。正常情况下，由于14-3-3蛋白是典型的胞浆酸性蛋白，几乎存在于所有组织的细胞浆中，所以TAZ SmBit会和14-3-3 LgBit蛋白结合生成有活性的萤光素酶，加入细胞膜通透性的底物Furimazine后，会产生化学发光信号。如果加入的化合物会直接/间接导致14-3-3和TAZ不结合或解离，则加入底物后无化学发光信号值或发光值降低（图3）。

图3：14-3–3&TAZ NanoBiT检测体系示意图

研究者分别从体系构建与确认，化合物筛选与hits剂量效应等多个维度对TAZ和14-3-3的相互作用进行了分析，所采用方法均为基于微孔板检测仪的化学发光检测方法，使用瑞孚迪 (Revvity) 的Envision超敏发光模块进行检测。实验流程如图4：

图4：14-3–3&TAZ NanoBiT药筛流程

结果

使用384孔板进行实验，每孔细胞数5000个（HEK293），培养时间48小时，TZA:14-3-3质粒比为1:10，可以得到最优的发光信号值，可用于后续的高通量筛选，Z prime＞0.7；

使用上述细胞培养体系，筛选了1408个化合物，约5%的化合物被发现为hits，其化学发光值相比对照降低了30%以上（图5）；

图5：14-3–3&TAZ NanoBiT药筛结果

选取典型的化合物，进行剂量效应测试，化合物具有明显的浓度梯度效应，进一步对6个化合物做检测，发现4个是Hippo通路特异性的，2个化合物还参与了其他平行信号通路的调节(图6)。

图6：典型Hits剂量效应评估

居于多功能微孔板检测仪的化学发光检测技术，是一个高灵敏，宽动态，易操作的检测技术，相对传统吸收光、荧光方法，其应用前景更为广泛，特别是在活细胞水平的蛋白互作研究，高通量药物筛选等领域。

瑞孚迪多功能微孔板检测仪，除了常见的吸收光，荧光，荧光偏振，激光时间分辨荧光等检测模式外，还具有非常丰富的化学发光检测模式，如多色发光，增强发光，超敏发光，其灵敏度高，孔间信号串扰低，线性范围宽，是目前相关领域极具信噪比的检测设备，可以满足用户各种通量和实验应用。

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参考文献

1. Andlovic, B., A. Wolf, M. Hiltmann, B. M. Klebl, J. Eickhoff and C. Ottmann (2024). "Development of a live cell assay for real-time monitoring the interactions between the Hippo pathway components 14-3-3 and TAZ." SLAS Discovery: 100191.

2. Boopathy, G. T. K. and W. Hong (2019). "Role of Hippo Pathway-YAP/TAZ Signaling in Angiogenesis." Frontiers in Cell and Developmental Biology 7.

3. Kango-Singh, M. and A. Singh (2009). "Regulation of organ size: Insights from the Drosophila Hippo signaling pathway." Developmental Dynamics 238.

4. Kim, W. and E. h. Jho (2018). "The history and regulatory mechanism of the Hippo pathway." BMB Reports 51: 106 - 118.

5. Zhao, B., K. Tumaneng and K. Guan (2011). "The Hippo pathway in organ size control, tissue regeneration and stem cell self-renewal." Nature Cell Biology 13: 877-883.