技术问答 | 抑制物？荧光PCR如何摆脱束缚，跑出漂亮曲线！

2024-06-14 13:41:13, 生物医药市场部 1有限公司

《荧光PCR技术常见困扰专题》进入第三篇，继之前的污染和交叉后，本期我们谈谈qPCR实验的又一个重要影响因素：抑制物。

荧光PCR的主要功能性成分为DNA聚合酶，常用的为Taq DNA聚合酶。该酶具有5''-3''端DNA聚合酶功能和3''-5''核酸外切酶活性，此外Taq酶还需要有Mg2+作为辅助因子激活。一些常见的生物体液样本、细胞/细菌培养液、疫苗/蛋白/酶发酵液等样本含有大量的杂蛋白、无机盐和其他化学试剂。这些试剂如果作为待检测样本，如果无法将上述抑制物去除，轻则会导致曲线异常，重则会呈现假阴性结果。

被抑制的阳性扩增曲线和阴性扩增曲线如图1和图2所示，图3是一个无抑制的阳性扩增曲线。图1和图2显示了一个共同的特点就是基线期不平滑且有扩增后期上扬（非正常扩增）的情况出现。

▲ 图1 | 被抑制的阳性扩增曲线

▲ 图2 | 被抑制的阴性扩增曲线

▲ 图3 | 无抑制的阳性扩增曲线

常见的荧光PCR抑制物有哪些？

qPCR INHIBITOR

@小微

蛋白类抑制物：血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白等大分子蛋白质，这种蛋白质可直接抑制taq酶活性，阻碍PCR反应的进行。

有机化合物：尿素（0.05mol/L以上）、叠氮化钠（0.1%以上）、苯甲酸钠（1%以上）、甲醛（1%以上）、十二烷基磺酸钠（SDS、5%以上）、吐温-20（1%以上）等物质在达到一定浓度后会可能会使Taq酶活性中心发生三级结构空间改变，使其失去结合引物—模板复合物的条件；或者竞争性结合Taq酶活性中心，阻碍Taq酶发挥作用。

血液抗凝剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA）、肝素。两者都可以螯合或吸附Mg2+，降低PCR体系中Mg2+的浓度，使Taq酶无法被激活；后者还可以代替引物-模板复合物作为Taq酶的竞争性底物。

金属离子：Ca2+、K+等。以Ca2+为代表的一类2价金属阳离子会与Mg2+竞争性结合Taq酶，但无法行使激活功能。当K+浓度达到0.075mol/L时，Taq酶会被完全抑制。

其他物质：例如可以改变PCR反应环境的pH值的物质、改变总离子浓度的物质、可变性Taq酶的物质等等都会对荧光PCR产生抑制。

如何解决抑制问题？

HOW TO RESOLVE

@小微

PCR抑制产生的根本原因是加入到荧光PCR体系中的核酸携带有抑制物质。因此，我们只需要在核酸纯化步骤尽可能的去除掉抑制物即可。因此，改进样本核酸提取和纯化方式是最有效的手段，针对于待检样本中可能存在的不同抑制物的特性选用相应的处理方法可以达到事半功倍的效果。

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