Cell子刊丨基于奥密克戎的线粒体生物学系统分析方法(SILAC)

2024-01-11 18:46:47 青岛腾龙微波科技有限公司


线粒体对细胞功能如代谢和细胞凋亡至关重要。它们通过调整蛋白质、核酸、代谢产物和脂质含量,动态适应不断变化的环境需求。此外,线粒体成分在不同水平上受到调节,以应对变化,包括丰度、活性和相互作用。已经开发了一系列基于组学的方法,能够探索线粒体适应以及线粒体功能在疾病环境中如何受损。本文提供了组学方法的概述,能够系统地研究线粒体生物学的不同方面。此外,还展示了这些方法如何提供新的生物学见解的例子。这些工具箱的新用途为线粒体功能的基本过程提供了更全面的理解。

A

根据组学方法,全细胞和纯化的线粒体都可以用作最佳输入样本。包括基因组学、核编码线粒体基因的转录组学、APEX-seq、核糖体图谱和用于翻译组学和N-末端组学的SILAC(mePROD)在内的技术可以在全细胞裂解物上进行。其他技术,如用于导入组学和代谢组学的SILAC(mePRODmt),需要预先进行线粒体纯化,通常通过差速离心或细胞均质后的亲和纯化来实现。然而,使用纯化的线粒体也可能优于其他方法,包括线粒体基因组中编码的线粒体基因的转录组学、复合体图谱、通过邻近标记的空间蛋白质组学(PL)和翻译后修饰(PTM)图谱,以减少非线粒体RNA和蛋白质引起的背景。

B

基于核酸的组学方法。细胞核或线粒体DNA都可以用作基因组分析的输入。使用机械或酶促方法将DNA随机片段化以产生短DNA片段。根据实验目的,可以对不同的RNA库进行转录组学分析。RNA片段化可以通过应用含有二价阳离子的溶液、碱性溶液或酶如RNase来实现。对于核糖体图谱,分离的多聚体用核糖核酸酶消化,获得与核糖体足迹相对应的短的、受核糖体保护的RNA片段。对于APEX-seq,用过氧化物酶APEX标记感兴趣的蛋白质,APEX用生物素共价标记相邻的RNA分子。在裂解之后,通过用链霉亲和素亲和纯化来提取生物素化的RNA。来源于转录组学、核糖体图谱或APEX-seq的RNA片段被逆转录为cDNA。大小在200–500 bp范围内的DNA或cDNA片段最常用于制备用于下一代测序的文库。

C

基于蛋白质的组学方法。用heavy氨基酸同位素进行几分钟到几个小时的脉冲标记,以用mePROD监测新翻译的蛋白质。在样品设置中包括由全重标记肽组成的加强通道,以增强样品中重标记肽部分的鉴定。在复合物组分析过程中,蛋白质复合物在天然条件下分离以保存组装的复合物。Native PAGE是最受欢迎的选择,因为它只需要低样本量。然而,其他技术,如尺寸排阻色谱法(SEC),在分离大型复合物时可能更优越。对于使用BioID的空间蛋白质组学,用生物素连接酶BioID标记感兴趣的蛋白质,其生物素化相邻的蛋白质。由于其对生物素的高亲和力,链亲和素通常用于从提取物中分离生物素化的蛋白质。在N-末端组学中,比较具有和不具有蛋白酶活性的样品,以鉴定来源于感兴趣的蛋白酶的蛋白水解切割的新N-末端。胰蛋白酶消化前的N末端标记或阻断是去除胰蛋白酶N末端肽的重要步骤。翻译后修饰(PTM)是动态的,大多发生在低化学计量下,这使得富含PTM的肽成为PTM分析过程中的重要步骤。

D

代谢组学监测不同物种的各种生物样本中的代谢产物,包括生物流体、组织和细胞。酶活性的猝灭对于保持代谢谱是至关重要的。在样品均化和提取过程中,代谢物通过不同种类的基于色谱的技术进行分离,其选择将影响以下核磁共振(NMR)或质谱(MS)分析中检测到的代谢物。

基于MS的蛋白质组学通过选择性标记和监测新合成的蛋白质为翻译体分析提供了一种替代方法。已经开发了几种使用不同标记方法标记新生多肽的策略,包括生物正交/定量非规范氨基酸标记(BONCAT/QuNCAT,用非天然氨基酸标记)、嘌呤霉素相关新生链蛋白质组学(PUNCH-P,用嘌呤霉素标记),以及通过细胞培养中的氨基酸进行脉冲稳定同位素标记(SILAC,使用具有重同位素的氨基酸进行标记). 对于脉冲SILAC方法,在有限的时间内向培养的细胞提供重标记的氨基酸,以允许在细胞收获和样品处理之前掺入新翻译的蛋白质中。该方法用于检测线粒体基质中蛋白质错误折叠对线粒体翻译的影响,并揭示线粒体蛋白毒性应激导致翻译抑制。重要的是,SILAC标记的蛋白质没有从裂解物中富集,标记和未标记的肽都通过质谱分析. 这使我们不仅能够量化新生多肽的量,而且能够量化总蛋白质丰度(标记和未标记肽的总和)。后者可用于样品标准化,这对于全局翻译抑制的情况特别有价值,如在内质网(ER)中观察到的线粒体功能障碍或蛋白质折叠应激。

然而,同时定量总蛋白丰度也存在技术困难,因为新合成的多肽仅占总蛋白的一小部分,因此其准确定量具有挑战性。这一技术限制可以通过应用多重增强蛋白动力学(mePROD)来克服,其最初被建立用于监测整个细胞翻译组。这种基于脉冲SILAC的方法利用完全SILAC标记的所谓加强通道,该通道被添加到样品设置中,以在MS分析过程中选择性地放大SILAC标记肽的信号(图2C)。增加的灵敏度允许在短至15分钟的SILAC脉冲后进行准确的定量,这使得在各种条件下检查急性翻译体反应成为可能。重要的是,增压通道的组成是可调节的。在最初的mePROD设置中,加强通道来源于全细胞裂解物,以放大全细胞翻译体的信号。然而,加强通道也可以从纯化的亚细胞级分中获得,以特异性地增加特定级分的新合成多肽的鉴定和定量,如我们对线粒体蛋白所示。使用这种设置,我们检查了急性线粒体膜去极化对线粒体蛋白翻译体的影响,并观察到整体翻译衰减,这取决于综合应激反应。

在细胞核基因组中编码并在胞质溶胶中翻译的线粒体蛋白需要线粒体输入。与翻译组学类似,由于合适的技术有限,旨在表征全球线粒体重要组分的研究很少。我们最近表明,可以改变mePROD方法,通过蛋白质组学来量化线粒体蛋白质输入,通过将mePROD设置与线粒体纯化(mePRODmt)相结合来量化线粒体内新合成和脉冲SILAC标记的蛋白质. mePRODmt用于分析线粒体功能障碍(如膜去极化和蛋白毒性应激)对线粒体重要组的影响。48,50这些研究表明,线粒体输入对线粒体功能障碍有很大影响,线粒体重要组由两个因素定义,即蛋白输入效率和翻译效率;两者都可能受到线粒体功能障碍的操纵。

将mePROD方法应用于离体组织样本和动物模型将是未来在疾病相关原位环境中进行翻译组和重要组分析的一个重要里程碑。这将需要在细胞培养条件下对离体组织进行脉冲SILAC标记,或通过使用SILAC饮食对动物进行短期标记。已经建立了几代人的长期膳食SILAC标签,并证明其对小鼠和苍蝇无害,标准化的SILAC饮食也可在市场上买到,这表明体内mePROD可能在不久的将来适用。

半衰期测量

延长SILAC标记的MS分析,即长达几天,可用于确定蛋白质半衰期(替换一半蛋白质库所需的时间)和周转率(替换蛋白质的速率)。为此,重与总的比率(给出“年轻”蛋白质的分数)或轻与总的比例(给出“老”蛋白质的百分比)是在多次SILAC标记后确定的. 最近在从人类胚胎干细胞分化的肌管和神经元中进行的一项研究发现,线粒体蛋白质的周转比其他细胞器的蛋白质慢,肌管和神经细胞的平均半衰期分别为5.5和7天。值得注意的是,蛋白质的周转因线粒体亚定位而异。尽管OMM蛋白显示出与全细胞平均值相似的周转,但位于膜间间隙(IMS)、线粒体内膜(IMM)或基质中的蛋白寿命更长,尤其是电子传输链的蛋白。在不同年龄的小鼠中进行的另一项研究表明,不同肌肉类型的线粒体蛋白丰度和半衰期随年龄的变化而变化。这种方法表明,大多数线粒体蛋白的半衰期随着年龄的增长而增加。未来在不同线粒体功能障碍的背景下对蛋白质周转的系统分析将揭示蛋白质翻译和降解在使总蛋白质丰度和功能适应不断变化的线粒体条件方面的作用和贡献。

SILAC & SILAM 助力蛋白质组学研究

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今日秋分

立秋,是“二十四节气之第十三个节气,也是秋季的起始。斗指西南太阳达黄经135°,于每年公历8月7或8日交节。”立”,是开始之意;“秋”,意为禾谷成熟。整个自然界的变化是循序渐进的过程,立秋是阳气渐收、阴气渐长,由阳盛逐渐转变为阴盛的转折在自然界,万物开始从繁茂成长趋向成熟。

SILAC: 细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC) 是在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白 质进行定性分析,还可通过质谱图上一对轻一重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平,实现对蛋白质的精确定量。

SILAM: (Stable Isotope Labeling of Mammals)利用SILAC技术对活体小鼠进行完全标记,则此标记的小鼠的任何部位的组织可以作为内(Reference)。利用SILAC技术原理结合LC-MS/MS,即可高通量的实现对您的小鼠模型特定组织蛋白质组变化的定量分析,筛选差异表达的蛋白质分子。

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