【一文了解】靶向蛋白组学定量技术SRM & MRM

2024-04-23 19:29:12, 核磁同位素学社 青岛腾龙微波科技有限公司


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·什么是SRM/MRM·

拟靶向扫描特定离子监测(SRM), 也通常称为多重反应监测 (MRM), 是复杂样品中靶蛋白定量的重要技术。SRM/MRM技术可以在复杂的系统中实现对靶蛋白的快速、灵敏、特异的定量,并具有良好的定量再现性。SRM/MRM技术消除了大部分非目标检测,使噪声信号大大降低,检测灵敏度显著提高。与ELISA相比,SRM/MRM具有更好的再现性、更高的产量、更低的开发成本和更高的稳定性。目前,SRM/MRM已迅速发展成为靶技术的代表性技术,并被视为基于质谱的蛋白质定量的“金标准”。

通过MRM/SRM技术进行实时定量监测有助于一系列研究,包括药代动力学、临床诊断、违禁物质检测、食品和化妆品的工业质量控制、环境监测、农业植物研究,以及代谢组学和基于蛋白质组学的蛋白质翻译后修饰和生物标志物发现相关研究。

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·SRM/MRM 原理·

SRM/MRM技术是基于已知或假设的反应性离子信息,针对性地选择数据进行质谱信号采集,去除不符合干扰的离子信号,通过数据质谱获得质谱定量信息。该技术中使用的主要仪器是三重四极质谱仪,其中第一和第三四极用作质量过滤器,专门选择与预设质荷比相同的肽离子(前体离子)。而碎片离子(产物离子)通过第二个四极作为碰撞细胞,通过CID(碰撞诱导解离)方式将前体离子击碎产生离子。SRM技术具有高选择性,降低了背景噪声和离子干扰。

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·SRM/MRM 技术优势·

Ø 高灵敏度:通过使用两级离子选择,消除了广泛的干扰离子,降低了质谱的化学背景。这显著提高了目标分析物的信噪比,实现了检测的高灵敏度。

Ø 优异的再现性:MRM选择性地获取质谱信号,避免了目标分子的电离、质谱信号的抑制以及源内碰撞引起的碎片化的影响。结果,再现性相应地提高。

Ø 高精度:利用MRM技术的特异性,进行连续的增强离子扫描,生成高分辨率串联质谱(MS/MS)片段数据。与全扫描和中性损耗质谱扫描模式相比,这降低了分析过程中定性结果的假阳性率,确保了分析的准确性。

Ø 高通量:利用最先进的质谱系统,MRM技术可以在每个工作循环中处理多达300对前体碎片离子。这一特性为研究众多蛋白质的各种修饰和丰度变化提供了机会,有效地满足了蛋白质组学的研究需求

Ø 无需抗体:适用于因缺乏抗体而无法使用蛋白质印迹或ELISA进行定量分析的蛋白质的验证和定量。这包括来自高度同源蛋白质家族的蛋白质、翻译后修饰的蛋白质(如磷酸化和甲基化的蛋白质),以及来自植物、微生物和模式生物的蛋白质。

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·SRM/MRM与免疫测定法

的比较·

SRM/MRM与我们常用的无标记iTRAQ/TMT定量蛋白质组学方法在质谱硬件和数据采集模式方面都有所不同。SRM/MRM采用基于三重四极质谱的选定扫描模式。借助于这种独特的数据采集方法,类似于WB和ELISA分析,SRM/MRM允许对靶蛋白进行选择性和特异性定量(或绝对定量)分析。

接下来看看SRM/MRM与WB和

ELISA相似和区别?

SRM/MRM vs. WB, ELISA.

SRM/MRM是无标签、iTRAQ/TMT和其他组学技术的宝贵伴侣。鉴于大规模组学技术中不可避免地会出现定量假阳性,结果往往需要通过特定的检测方法进行验证。最传统的方法包括WB和ELISA,SRM/MRM也经常用于验证目的。

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·SRM/MRM 工作流·

SRM/MRM分析开发。这是该方法的核心。首先,应从光谱库生成或Skyline软件中选择2或3个靶向肽。所选择的肽应该是感兴趣的蛋白质所特有的,并且易于通过LC-MS检测。它们还不需要缺失的切割位点和频繁修饰的氨基酸。还应选择产物离子。其次,应优化检测条件,如碎片能量和循环时间。第三,在x轴上建立了相应的浓度比和y轴上的峰面积比的工作线性曲线。样品分析。消化后,样品在三重四极质谱仪上进行。数据将使用Skyline软件进行分析:

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