野生蘑菇中鹅膏肽类与色胺类毒素的测定

蘑菇毒素种类繁多,化学结构差异大,为了实现蘑菇中毒素的准确、高通量分析,本文采用固相萃取净化技术,以高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)为分析手段,建立了蘑菇中5种鹅膏肽类、2种色胺类蘑菇毒素的分析方法。优化了色谱条件、质谱参数和样品提取净化方法,蘑菇干粉以含0.3%甲酸的甲醇提取,强阳离子交换柱(SCX)净化后,待测样液用T3色谱柱分离,以含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈为流动相进行梯度洗脱,采用多反应监测模式(MRM)扫描,以基质匹配标准曲线法对鹅膏肽毒素定量,以同位素内标法对色胺类毒素定量。结果显示,7种毒素在一定的浓度范围内与峰面积(或峰面积比)均呈良好的线性关系(r²>0.99)。蟾蜍色胺、脱磷裸盖菇素、鹅膏肽类毒素的检出限(LOD)分别为2.0、5.0、10 μg/kg,定量限(LOQ)分别为5.0、10、20 μg/kg;以香菇干粉为基质,在3个水平下加标,5种鹅膏肽类毒素的回收率为71.8%~115%,相对标准偏差(RSD)为2.14%~9.92%; 2种色胺类毒素的回收率为80.6%~117%, RSD为1.73%~5.98%;与国家市场监管总局食品补充检验方法BJS 202008进行比对,结果表明鹅膏毒素含量具有可比性,无显著性差异(p>0.05)。该方法简便、快速,准确度和精密度较高,符合要求,适用于野生蘑菇中7种蘑菇毒素的检测。采用该法开展了福建省野生蘑菇中蘑菇毒素分布情况的调查,在全省9个设区市采集了59份野生蘑菇样品,采用核糖体DNA内转录间隔区(rDNA-ITS)分子条形码技术进行了种属鉴定,在2份样品中检测出了蘑菇毒素,在1份拟灰花纹鹅膏(Amanita fuligineoides)干粉提取物中检出α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽,含量分别为607、377、69.0 mg/kg;在1份口蘑科(Tricholomataceae)蘑菇中检出脱磷裸盖菇素,含量为12.6 mg/kg。

称取0.2 g(精确至1 mg)蘑菇干粉于15 mL离心管中,准确加入10 μL 1.00 mg/L内标混合标准使用液,再加入5 mL 0.3%甲酸(优级纯)甲醇溶液,涡旋混匀,在30 ℃下超声提取15 min,以9000 r/min的转速离心10 min,再重复提取一次,合并提取液,添加10%(质量分数,下同)抗坏血酸溶液50 μL后,提取液于40 ℃下减压蒸馏至近干,用2 mL 0.3%甲酸水溶液(含0.05%抗坏血酸)洗涤鸡心瓶内壁。将溶液转入用3 mL乙腈、0.3%甲酸水溶液活化平衡好的SCX柱中,分别用1 mL 0.3%甲酸水溶液、1 mL 0.1%甲酸水溶液淋洗,然后用2 mL氨水-甲醇(5∶95, v/v)洗脱,于40 ℃下氮吹至近干;准确加入1.00 mL 0.05%抗坏血酸溶液复溶,混匀后,以12000 r/min转速离心5 min,取上清液测定。

液相色谱条件 HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm,美国Waters公司);柱温:40 ℃;流动相A: 5 mmoL/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸(色谱纯));流动相B:乙腈;梯度洗脱程序:0~3.0 min, 5%B; 3.0~5.0 min, 5%B~40%B; 5.0~6.0 min, 40%B~95%B; 6.0~7.0 min, 95%B; 7.0~7.5 min, 95%B~5%B; 7.5~10.0 min, 5%B。流速:0.3 mL/min;进样量:10 μL。

质谱条件 电喷雾离子源正离子模式监测(ESI⁺);雾化气、干燥气和加热气分别为氮气、氮气和空气,流量分别为3.0、10和15 L/min;碰撞气:氩气;脱溶剂管、接口和加热块温度分别为250、400和400 ℃; 7种蘑菇毒素及其内标的监测离子对及质谱参数见原文表1。

实验数据以“平均值±标准差”表示,采用Excel整理数据,SPSS 25.0进行实验数据分析。各指标数据均进行正态性检验和方差齐性检验,两组间比较采用双侧检验,检验水准α设定为0.05,当p<0.05表示差异有统计学意义。当数据满足方差齐性,进行t检验;数据不满足方差齐性时,进行非参数检验。