氨基酸分析仪检测奶粉中的乳清蛋白

一、  样品前处理

1、所用试剂

1.1 Loading Buffer(上样液)：钠盐系统，pH 2.2

1.2 过甲酸溶液：30%双氧水+88%甲酸按(V:V=1:9)混合，于室温放置1h，再放到冰水中冷却0.5h，制备完尽快使用

1.3 偏重亚硫酸钠：33.6g/100mL

1.4 盐酸：6.0mol/L

1.5 氨基酸标准品

2、前处理设备

1）分析天平:精度为 0.0001g

2）移液枪及枪头

3）容量瓶及胶头滴管

4）0.22μm滤膜

5）一次性注射器

6）低范围pH试纸

7）离心机

3、样品制备（参考标准：AOAC 994.12-1997；ISO 13904）

样品为奶粉，而我们所关注的是其中的乳清蛋白所占总蛋白含量的比重，为了便于测试，我们默认将所有测定的氨基酸之和作为所测蛋白的含量，故为了准确测定样品中所含所有氨基酸，前处理做如下处理：

3.1 乳清蛋白的提取：

A. 从样品溶解完全的容量瓶内吸取样2mL，在4℃，6000r/min，下离心20min(去除乳脂层)，再置于15000r/min下离心60min(除去酪蛋白)，获得乳清部分

B. 处理后样品加入10mL 6.0mol/L盐酸溶液及几滴消泡剂

C. 抽真空状态下（游离氨基酸易氧化）以熔焊机封口，置于110℃烘干箱中水解24h

D. 冷却后液体转入50mL容量瓶，反复冲洗水解管、漏斗、玻璃棒等，定容至50mL

E. 取定容后溶液2mL至蒸发皿中，加热蒸干后再加少许水，反复1-2次

F. 加入2mL 上样液，混匀后过0.45μm滤膜，上机待测

3.2 酸水解前处理：

A. 称取50-75mg(约含蛋白质7.5-25mg)的样品于20mL安瓿瓶中(切勿贴壁)

B. 加入10mL 6mol/L盐酸，抽真空至小于7Pa后封口(或氮吹将瓶内空气排掉亦可)

C. 封口后的安瓿瓶放入110℃恒温干燥箱内水解22-24小时

D. 冷却、混匀、开管、过滤、定容，取适量滤液置于旋转蒸发仪中，60℃以下抽真空，旋蒸干，加少许水，反复1-2次

E. 加入2mL上样液，混匀后过0.45μm滤膜，上机待测

注：也可以使用浓缩仪取代D

3.3 氧化水解前处理：

A. 称取50-75mg(约含蛋白质7.5-25mg)的样品于20mL安瓿瓶中(切勿贴壁)

B. 置于0℃冰水中加入2mL预冷的过甲酸溶液，加液时需将样品全部润湿，但不能摇动

C. 0℃冰箱中反应16小时

D. 加入33.6%偏重亚硫酸钠溶液0.5mL，混匀后，直接加入17.5mL 6.0mol/L盐酸，封口(无需抽真空)

E. 110℃恒温干燥箱内水解22-24小时(注：开始水解时安瓿瓶切勿封口，等水解1h后再封口，否则容易引起炸裂)

F. 冷却混匀开管，用水将内容物定量转移至50mL容量瓶中，用7.5mol/L的氢氧化钠中和至pH2.2，再用上样液定容混匀，0.45μm膜过滤后，供上机用

G. 氧化水解过程中，Tyr将被完全破坏，His部分被破坏。但是会保留Cys和Met

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

氨基酸分析仪分析方法参数：

1. 色谱柱：Biochrom Na型阳离子交换树脂柱，4.6x20cm

2. 分离程序：

3. 运行时间：分析时间+再生时间共88.39min

4. 反应单元温度：135°C

5. 检测波长：570nm、440nm同时检测

三、计算

样品测定液氨基酸的含量按式(1)计算:

C_i = C_s/A_s × A_i× F ························· (1)式中:

C_i ——样品测定液氨基酸i的含量,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);

C_s ——氨基酸标准工作液氨基酸s的含量,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);

A_i ——试样测定液氨基酸i的峰面积;

A_s ——氨基酸标准工作液氨基酸s的峰面积;

F  ——样品稀释倍数。

附分析结果表：

因为酸水解前处理会破坏胱氨酸、蛋氨酸，色氨酸无法测出；氧化水解会破坏酪氨酸、组氨酸。所以为了确保实验的准确性，分别对样品进行酸水解和氧化水解，最终分别将两种方法测得的氨基酸含量之和作为相对应的蛋白质含量，即乳清蛋白/奶粉蛋白=Ox(Hyd)乳清蛋白AA/Ox(Hyd)奶粉蛋白AA。h

结果表