从“药王”阿达木单抗纯化工艺，看毫厘高分辨率离子交换层析介质如何助力抗体生产

离子层析是应用最广泛的一种层析方法，在单抗纯化工艺中主要作为精细纯化的手段。在单抗发酵过程中，细胞培养液通常为中性pH环境，表达出的抗体经细胞分泌后，即带有正电荷。如果抗体在生产工艺中，反复跨越等电点，会增加其聚集、沉淀、产生变体和失活的风险，不仅为后续纯化过程增加了难度，同时也会降低整体收率，增加生产成本。所以在后续工艺中合理的控制实验条件，维持单抗带正电荷的特性，有助于工艺的开发，当然，根据不同的单抗性质，也要做出合理的调整。对于带正电荷的单抗分子，在阳离子层析纯化过程中，采用结合洗脱模式；在阴离子层析过程中，使用流穿模式层析，不同的层析模式在抗体纯化中的作用也不相同。

单抗经SpreX ProA D80/H60亲和层析、低pH病毒灭活和深层过滤后，此时主要杂质包括HCP、HCD、聚体、电荷异质体以及微量亲和层析填料脱落的Protein A配基等，而去除这些杂质实现进一步精纯，主要利用杂质与抗体在带电性上的差异，通过离子交换层析实现分离。

在阴离子层析阶段能够对蛋白进行进一步的精纯，去除的杂质包括HCP、HCD、病毒、内毒素和ProteinA等，这些杂质能够被阴离子交换层析介质吸附，而带有正电荷的抗体分子则流穿。在此阶段，对介质分辨率要求不高，更加考验介质的综合性能，建议使用高流速高耐压的阴离子层析介质SpreX Q等。

除了以上杂质外，阴离子层析的除病毒效果在单抗纯化中也十分重要。单抗的培养表达使用的真核细胞可能成为污染源，单抗的给药方式是静脉注射，抗体药物的申报中也对除病毒效果以及最终产品中病毒含量也有着严格的要求，因此单抗药物纯化过程中的除病毒效果是必须考虑的问题。虽然ProA亲和层析、低pH病毒灭活、除病毒过滤等都有一定的除病毒效果，但是通常都需要加入阴离子的除病毒作用才能使总体的病毒去除率有所保证。因此，单抗纯化的工艺中阴离子具有十分重要的地位。

以某阿达木单抗的纯化为例，该蛋白等电点为8.3，在pH5.3-6.5时具有较好的稳定性，同时在pH5.7条件下进行阳离子层析能够较好的去除电荷异质体，阴离子层析则在较宽的pH范围内都具有比较好的除杂效果。为了减少不必要的操作步骤，最终选择在pH5.7的条件下进行阴离子离子层析，其完整的层析流程包括以下阶段：

阳离子层析的一个重要作用是能够去除电荷异质体。蛋白表面一般都含有大量的带电荷基团，抗体分子翻译后修饰或降解的发生导致其等电点或空间电荷分布等表面电荷特性发生改变，从而导致了电荷异质体的产生。根据蛋白所带净电荷的不同，可以根据基于电荷的纯化方法将蛋白分为酸性电荷异质体、中性主成分和碱性电荷异质体。酸性和碱性电荷异质体与中性主成分在临床效果通常会有差异，所以在纯化阶段需要对各种电荷异质体的杂质进行去除。

当最终纯化工艺采用阳离子交换层析时，料液已经过多次纯化，原液成本高昂；且分离电荷异质体和聚体等杂质需要介质具有更高的分辨率，推荐使用粒径均一、分辨率高、载量高、耐压高的SpreX S D40进行层析，毫厘科技基于全球领先的微流控微液滴成球技术，对层析介质生产过程的可控性更强，能够生产出粒径高度均一的介质产品，在分辨率上带来更多的惊喜。

以前文阴离子层析中的单抗纯化为例，在阴离子层析后使用阳离子层析去除电荷异质体，完整的阳离子层析过程如下：

由于聚体比单体的结合能力更强，也能通过离子结合能力强弱进行分离，但两者之间的分辨率较差。推荐的做法是选择合适的洗脱液后设定一个比较高的收集结束峰值，因为一般收集峰的尾部聚体含量比较高。但过高的收集结束峰值又会导致收率降低，因此也需要进行一定研究后得到一个合适的峰值。

阳离子的除病毒能力相比于阴离子较弱，一般能达到1-3log10 ，而阴离子则能够达到5-7log10，因此阳离子的除病毒效果一般只作为一个补充。有研究数据显示，在一定条件下，阳离子层析可实现MuLv、PRV和Reo-3的＞4log10的病毒清除率，这与层析的pH条件相关。但在所有pH条件下，MMV的清除率都不高。MuLv的pI为5.8，MMV的pI为6.2，由此可推测，阳离子层析的病毒清除机制并非单纯的电荷作用。

本文基于目前对单抗纯化的一些行业经验，结合国内外一些研究，以及部分具体案例，总结了离子层析在单抗纯化中的部分应用。文中的单抗纯化只针对大多数情况，另有少部分等电点差别较大或是前期处理方法不同的单抗纯化项目，毫厘科技也能提供其它种类的层析填料如SpreX Q D40、SpreX S、SpreX MMA、SpreX MMC、SpreX MMC D40等满足您的需求。

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