从原理到实操｜深度全解抗体纯化蛋白A亲和层析工艺，收率再上新高度

近些年单抗市场发展迅速，从2008至2022年，全球生物制品市场份额从17%增长至30%，大约50%生物制品销售额来自于抗体及其Fc融合蛋白。近些年，中国单抗药物市场呈爆发性增长趋势，2022年销售额已达1100亿，预计2023年将突破1500亿，而国产单抗药物也陆续实现突破，近些年不断有新的单抗药物上市。

但在单抗快速发展的同时，制药企业也面临着新的挑战。首先是降低生产成本，由于热门靶点有限，可能同一款单抗药物有多个公司在同时研发药物，制药公司面临着激烈的市场竞争，同时由于国家4+7带量采购的政策的发布，迫使药企迫切追求降低生产成本。其次是提高生产效率，除部分热门靶点药物外，大部分靶点药物市场需求量小。最后是产品质量控制，随着中国加入ICH，和国际药品监管体系接轨，对药品质量和生产过程有了越来越严格的要求.

目前单抗在纯化阶段多采用三步层析纯化策略，ProteinA亲和层析因为其高特异性，成为第一步粗纯的首选。

ProteinA是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，通过Fc片段结合哺乳动物IgG。天然的ProteinA不稳定，将其改造后获得的ProteinA不仅稳定性更好，而且对Fc片段的结合能力更强，非特异性结合更弱。将这种蛋白结合到微球上，便获得了一种能够特异性结合抗体蛋白的层新填料。SpreX ProA系列产品中结合的PeoteinA蛋白是经过改造后的蛋白，可耐受高达0.5M NaOH，实现在使用结束后对填料更加彻底的清洁消毒。

以等电点在8左右的抗体蛋白为例，一般的粗纯流程如下：

培养收获液经澄清过滤或离心分离后去除大的细胞和细胞碎片，再用0.45/0.22um的滤膜过滤，以使样品能够顺利通过而不至于堵塞层析柱，随后便可将进行Pro A亲和层析。层析中用到的所有缓冲液都要用0.45/0.22um的滤膜过滤，尽可能减少不溶性微粒，并降低微生物限度以减少使用过程中填料的损伤。典型的ProA亲和层析步骤包括：

样品经过一步层析后一般单体纯度可达95%以上，收率为90%左右，主要杂质为聚体、电荷异质体、HCP、DNA和ProteinA。其中聚体和电荷异质体等在亲和层析阶段优化空间不大，另一方面是这些杂质在后续离子层析阶段可以去除，因此一般不作为亲和层析工艺优化关键点。Protein A是由于填料配基脱落所导致，一般只需维持在较低水平即可，而且也可以在离子层析阶段去除，但其含量可作为填料自身性能变化的参考。因此，亲和层析阶段的工艺参数优化应重点关注收率、HCP、DNA和ProteinA.

样品收率与样品上样载量密切相关。高流速、高载量是目前亲和层析填料发展的趋势，选择更高载量的填料以及合适的实际上样载量能够获得更高的收率，同时降低生产成本。毫厘科技的SpreX ProA D80能够在4min保留时间下达到60 mg hIgG/mL以上的动态载量，其平均粒径为80un，能够实现0.2MPa下500cm/h的流速，让生产过程更加高效。SpreX ProA H60则粒径更小，载量更高，为工艺开发带来更多选择。填料的高动态载量还应结合实际的工艺参数，过高或过低的上样载量都会导致收率降低，因此从低载量填料更换为高载量填料，还应进行对应的工艺优化实验。随着亲和层析填料使用次数的增加，其微球表面附着的杂质也会越来越多并降低目标蛋白的载量。此外洗脱pH、收集峰位置也会影响收率，高的洗脱pH和窄的收集峰会降低收率，但可以提高产品质量；低的pH和宽的收集峰会提高收率，但会使产品质量降低。工艺条件的优化目标是在质量和收率之间的平衡，即在保证质量的情况下尽可能提高收率。

目前抗体蛋白主要采用真核细胞胞外表达，HCP和DNA会在培养末期或离心过程中细胞死亡后释放出来，通常在亲和层析前其含量可能高达几十万甚至上百万ppm，而在亲和层析后则下降到几百ppm。HCP和DNA在pH5.5左右时一般带负电荷，可回调pH后通过深层过滤去除，若对质量有更高要求也可通过阴离子层析去除，同时阴离子层析还能去除核酸和病毒，且由于单抗的阴离子层析通常是流穿模式层析，工艺相对简单，被普遍应用于单抗的纯化。

亲和后样品中含有的ProteinA一般来源于亲和填料配基的脱落，其一方面作为产品杂质应当被控制，另一方面也可作为填料配基脱落程度的参考。使用SpreX ProA系列填料进行亲和层析，Protein A的含量可保持在10ppm以下。一般对填料配基脱落影响最大的因素是CIP阶段的氢氧化钠清洗。为了洗去填料上未洗脱的脂蛋白，灭活内毒素以及控制微生物限度，一般会在层析前和层析后使用0.1M NaOH进行15min左右的消毒，这对亲和层析填料来说是必须的，但会极大影响配基的稳定性，SpreX ProA系列填料使用经改良的Protein A配基，能够耐受0.5M NaOH，增加在0.1 M NaOH下的使用寿命。

以当前纯化工艺发展情况，亲和层析填料通常占据所有层析填料成本50%左右，在当下制药行业整体降本增效的背景下，国产化已成为趋势。毫厘科技全球领先的微流控微液滴成球技术过程可控，并且能够制造出粒径更加均一的微球，使用SpreX ProA系列填料将可能在样品收集阶段的分辨率、收集体积带来更好的表现，从而降低后续纯化阶段生产成本。

为了满足高性价比产品的巨大需求，同时满足严格的质量标准，对生产策略进行了必要改进，人们设计并研究了蛋白A的替代配体。蛋白质G和蛋白质L是已知的与蛋白质A功能相似的配体。蛋白质G由一个多肽组成，多个结合域以圆柱形连接;蛋白G由1个具有多个结合域的单肽组成，来源于G群和C群链球菌。然而，ProteinG比ProteinA没有太大的优势，最重要的限制是洗脱的pH太低，非特异性行为升高，聚集体含量高，稳定性下降，综合成本甚至高于ProteinA 树脂。ProteinL也是由链球菌表达，会与包含特定kappa轻链的抗体特异性结合，由于其高特异性，蛋白L在单抗纯化过程中尚未取代ProteinA。

ProteinA并不能结合所有IgG，而且有的抗体蛋白中并不含有Fc段，因此会有基于ProteinL或其他亲和配体的亲和层析。但这些产品仍需在载量、稳定性等方面改进才能使性能超过基于ProteinA的亲和层析。