TaqTalk 26期 | 实时荧光PCR需要稀释cDNA吗？

稀释还是不稀释？这是个问题。

在本期Taq Talk视频中，我们将讨论您是否应该在运行实时荧光PCR之前稀释制备好的cDNA样品。我们还将讨论为什么可能需要在反转录之前稀释RNA。我们考虑了许多参数，包括最终反应体积和基因表达水平。

很大一部分基因表达研究人员在运行反应之前稀释了cDNA。有些人按1:3稀释，有些人说1:5更好，而有些人坚信1:10最好。许多为了使研究更完善而故意唱反调的研究人员会很乐意告诉你，稀释cDNA完全是浪费时间，完全就是试剂级别的水！那么孰对孰错呢？嗯，就像生命科学中的许多事情一样，要视情况而定。为了让您理解我的意思，让我们稍微来谈谈有些人选择稀释cDNA的主要原因。

第一个原因是担心高浓度的cDNA会对PCR产生负面影响，特别是在它含有初始RNA分离步骤残留的抑制剂的情况下。

嗯，是也不是。确实抑制剂会对PCR产生影响。但是cDNA的稀释度往往相当高，因此很少有抑制化合物的量足以引起问题。

也就是说，如果原始RNA样品在RNA制备后真的很脏或含有大量乙醇等残留化学物质，那么逆转录很可能不成功。那么，为什么实时PCR反应会失败呢？原因通常不是脏的cDNA，而是不成功的RT只能产生极少或无法产生cDNA！这就是为什么在执行反转录步骤之前，RNA应始终保持绝对干净。

需要注意的是，反转录缓冲液可以抑制PCR，特别是在它们占最终体积20%以上的情况下。

如果您没有稀释cDNA，请不要在25微升的反应混合物中添加超过5微升的RT反应物。

人们稀释cDNA还有另一个原因。他们担心过多的cDNA会导致管家基因（特别是像18s这样表达非常高的基因）在循环期间出现得太早，以至于无法设定准确的基线。

我同意，这确实值得担忧，这可能是很好的稀释理由。只要确保避免稀释度太高以致目标基因的Cts漂移到30s中后期即可，因为这种漂移本身可能会导致问题。最后需要注意的是：用户始终可以限制初始RT反应中的RNA量。

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