2023-11-07 14:59:36, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
前言:目前已有几种基于寡核苷酸的疗法获得了美国食品及药物管理局(FDA)的批准,但由于寡核苷酸的合成和降解途径复杂,涉及复杂的化学修饰,会产生数以百计的杂质,因此,使核酸的分离具有挑战性。而所有治疗用寡核苷酸在进入人体前都必须经过化学修饰,其中一种修饰是硫代磷酸酯(PS)修饰,这种修饰会产生非对映异构体:对于 20 核苷酸长的 PS 寡核苷酸,非对映异构体超过 50 万个。¹ 本文,我们介绍三乙胺乙酸如何助力治疗用寡核苷酸分析,尤其是在核酸定量分析和表征检测中如何发挥作用。
TEAA是什么?
三乙胺乙酸( Triethylamine Acetate,TEAA )是一种离子对试剂,本身是疏水性,同时又带正电荷,一方面,TEAA 的疏水基团又与固定相上碳 -18 链的疏水基团发生反应,另一方面,TEAA与核酸主链上的磷酸基团的负电荷反应。
而实现核酸分离是根据其碱基数目、构象、疏水性等特性,如,核酸中的磷酸基团带负电,RNA分子呈亲水性。像TEAA这种离子对试剂,起着连接核酸和柱基质之间的桥梁作用,使核酸吸附在固定相上面,然后,通过改变流动相中乙腈的浓度实现核酸的分离。换而言之,TEAA通过在核酸与柱基质的相互作用,从而分离核酸。
TEAA的应用场景
01
TEAA用于mRNA的HPLC的纯度和定量分析
在Europe PMC上报道了一项研究,用TEAA配制HPLC的缓冲液,纯化后,降低了mRNA的免疫反应,产生的mRNA不会诱导IFN和炎性细胞因子,并且,在原代细胞中的翻译水平提高了10 ~ 1,000倍。² 其中,缓冲液配制方法如下:
缓冲液 A 含 0.1 M 三乙胺乙酸 (TEAA),pH = 7.0;
缓冲液 B 含 0.1 M 三乙胺乙酸,pH = 7.0 和 25% 乙腈。
可见,用TEAA配制的HPLC的缓冲液,降低了免疫反应,提高了mRNA的翻译效率,加速了mRNA从体外干细胞生成到体内基因治疗的研究进展。
02
TEAA用于mRNA Mapping 的LC-MS分析
在2022年Analytical Chemistry报道了一项研究,通过开发了一种自动化、高通量的工作流程,用于快速表征大RNA 和 mRNA 治疗药物并直接绘制序列图。其中,mRNA mapping分析中,将RNase T1消化后直接溶解在TEAA中。³ 随后,使用TEAA配制的缓冲液,进行质谱分析:
缓冲液 A 由 pH 值为 7.0 的 100 mM 三乙胺乙酸(TEAA)组成;
缓冲液 B 由 pH 值为 7.0 的 0.1 M TEAA 组成,其中含有 25% 的乙腈
使用TEAA配制的缓冲液,在mRNA Mapping 的LC-MS分析后,获得了>80% 的序列覆盖率的大 RNA 和 mRNA 治疗药物,在90分钟内即可完成,大大缩短了分析时间。
03
TEAA用于mRNA加帽加尾的LC/MS分析
在2022年Europe PMC上报道了一项研究,目的是开发一种流动相混合物,可以通过质谱法减少寡核苷酸的电荷态和加合物形成的数量,并使用这种流动相混合物来检测mRNA的加帽效率和polyA尾长。通过在流动相A中使用30mMHFIP, 10mm TEAA和1.2 mM TEA和乙醇的混合物,分析polyA尾长和加帽效率,而不需要在消化后进行额外的样品制备。通过使用含有TEAA的流动相,无需在质谱分析前对样品进行脱盐处理,大大减少了样品制备时间和分析所需的 RNA 量。⁴
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近年来, 随着越来越多的文献报道,TEAA凭借其独特的离子对性质,不仅可用于核酸HPLC的纯度和定量分析,而且在核酸的LC/MS分析上也发挥重要作用,相信未来,TEAA在核酸分离上会有越来越多的应用被科研工作者发现。
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