转载：人体呼出气体检测 — 新型体外诊断方式（更新版）

选择性离子流管质谱（SIFT-MS）是一种成熟的呼气分析方法，已被广泛应用于健康人体呼出气体研究，同时也有一定数量的临床研究。大多数研究利用了SIFT-MS的优势进行目标物分析，如胃食管反流病患者的乙酸定量，或2型糖尿病患者呼气中丙酮的定量分析。

SIFT-MS的原理如图1所示。它是基于化学电离的原理，简单来说，在微波等离子体中产生反应物离子(H₃O+，NO+和O₂+)，并经过四极滤质器选择所需的离子。而后反应物离子被引入一个充有氦气的漂移管，待测样品也在此处被引入，二者在此处发生反应，样品分子被电离，生成的样品离子被一个低分辨的四极杆质谱仪检测。

SIFT-MS的LOQs范围在pptv-ppbv之间，其质量范围最高到300 Da，质量分辨率则受四极杆质谱仪的限制，因此同分异构体和相同质量数的化合物不能被分离（小编注：四极杆质谱也不允许非靶向物种鉴别non-targeted analysis）。对相同质量数的化合物进行分析的一种方案是使用多种反应物离子进行选择性离子化，如醛和酮可以利用其与H₃O+或NO+的化学反应不同而进行区分。

质子转移反应质谱（PTR-MS）始于环境研究领域，近年来在生命科学领域的应用研究越来越多。和SIFT-MS一样，PTR-MS依赖于化学电离。基于来自反应物离子的质子转移，待测样品被电离并通过质谱分析。然而，与SIFT-MS相比，这种方法主要使用H₃O+作为质子源。如图2所示，水蒸气被引入离子源中放电，产生了主要成分为H₃O+离子的羽流。之后离子羽流通过与H₂O的碰撞反应得到进一步纯化。与SIFT-MS不同的是，PTR-MS不需要使用额外的四极滤质器，产生的（小编注：同时高浓度）纯反应物离子羽流直接引入漂移管，气态待测样品在漂移管中被电离，随后用质谱仪分析样品离子。由于漂移管长度固定，质子从试剂离子转移到样品的反应时间也固定，因此可以进行定量分析（小编注：更重要的是对无法做标定的物种做半定量分析，对于呼气中常见的活性含氧化合物及其关键，极大的拓展了可检出的分析物种种类和浓度信息）。但是在漂移管中，萜烯一类的挥发性有机化合物会破碎，极大地复杂化了质谱分析和绝对定量。由于样品气本身在漂移管中充当缓冲气体，避免了样品的稀释，因此与SIFT-MS相比PTR-MS具有更高的灵敏度（小编注：PTR-MS灵敏度更高的一个主要原因是无需SIFT离子源后端的四级杆进行母离子进一步筛选，因为PTR-MS离子源尝试的母离子已经足够纯，一般97%或以上）。 

PTR-MS的质量分析器类型包括四极杆(PTR-Q MS)、TOF质量分析器(PTR-TOF MS)，以及四极杆与TOF的联用(PTR-QTOF MS)。新型PTR-TOF仪器的质量分辨率m/Δm高于10000，这是化合物识别的关键。商品化的PTR-MS已被用于癌症筛查、新冠诊断的研究。

1986年和1994年，Fenn课题组和Hill课题组发现，电喷雾电离(electrospray ionization, ESI)不仅能够电离溶解在喷雾溶剂中的分子，也能够电离存在于电离区环境中的化合物。他们意识到电喷雾形成的初级离子可以诱导与电喷雾接触的气相分子发生二次电离。这最终被Hill和同事在2000年报道为一种独立的技术，并被称为二次电喷雾电离质谱（SESI-MS）（小编注：同时间在瑞士ETH Zenobi课题组陈焕文老师也开展了Extractive ESI/EESI方法的研发和呼气分析应用）。SESI-MS的原理如图3所示。在纯净的溶剂内添加能够增加电导率的添加剂，通过电喷雾以产生初级离子。然后，待测样品气化后被引导到电喷雾上，通过质子转移反应电离。这个过程是软电离过程，对大多数反应来说主要产生分子离子，到目前为止，人们对其机制还没有完全了解。

SESI-MS对极性化合物最为敏感，其灵敏度能够达到低于ppbv级别。除了电离时的高效和软电离特性，SESI最大的优点是其模块化。由于它能够在环境压力下工作，因此它可以和现在任何敞开式进样的质谱仪相结合（小编注：SESI和EESI都适配于TOFWERK API TOF质谱系列），这允许使用最先进的高分辨率质谱仪的MS/MS功能。迄今为止在线呼吸气分析得到的最高质量分辨率(>140,000)和最大质量范围(m/z > 600)便是此种检测方式得到的。

虽然SESI是一项较新的技术，但是研究者已经将其拓展到各种各样的应用范围中，包括非法药物、化学战剂和爆炸物的检测，以及食物和皮肤的分析，细菌培养以及最重要的呼气检测。

膜进样质谱仪（MIMS）是通过半透膜结合质谱仪直接采样气态、液态或固态样品中的分析物。膜(基于聚二甲基硅氧烷或全氟磺酸/聚四氟乙烯材料)作为屏障，通过渗透蒸发过程排除样品基质保留分析物。最常用的电离方法是电子电离源和化学电离源，后者减少了分析物的碎裂并避免了谱峰重叠。

近年来，基于MIMS的一些方法已被开发用于人类疾病的诊断/治疗、生理缺陷的检测和健康风险的识别。从呼吸气中获得的人体化学特征也被用于侦查非法贩卖人口，非法运输受限或有害物质，以及自然灾害后受害者的早期定位。在这种情况下，质谱仪的小型化非常重要。与其他非分离技术相比，MIMS的尺寸、成本和重量更低，为实时分析提供了可能。

飞行时间质谱仪也可用于分析呼气中的VOCs，其主要优点是高质量分辨率和在短时间内能够获得多张谱图。GC-TOF-MS已成功应用于肺癌的临床检测，Gaspar和同事研究了健康志愿者、吸烟者和非吸烟者，以及化疗前和化疗后肺癌患者呼出气成分的相关性。他们聚焦于单链和支链的C8到C24的碳氢化合物。在0.04至8.0 ppbv水平的灵敏度和低于26%的RSD表现出了该方法的有效性。

人体受到感染后，呼气VOCs中除了人体正常代谢产物外，还包含了微生物病毒代谢过程的产物，以及人体对感染以及炎症应激反应过程所产生的代谢产物。因此，呼气VOCs的指纹图谱发生变化，有望成为感染性疾病的早期快速检测的突破口，具有重要社会价值和广阔的临床应用前景。

美国食品和药物管理局在4月份紧急授权使用 InspectIR研发的一款呼气质谱 Breathalyzer。该仪器是一款便携式的气相色谱四极杆质谱（GC-MS），采用气相色谱对复杂的呼气VOCs成分进行分离，用四极杆质谱技术对分离后的VOCs进行检测和鉴定分析，可快速检测呼气样本中与新冠病毒感染有关的5种醛酮类VOCs（小编注：这5种醛酮类VOCs均是PTR-MS的理想检测物）。根据FDA发布的声明，在一项针对2409人的研究中，InspectIR的新冠呼气检测产品的敏感性为91.2%，特异性为99.3%。InspectIR 表示该测试比 PCR 甚至快速抗原测试的侵入性更小，速度更快，因此可能对办公室、餐馆和机场等公共场所有用。

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食管癌是常见的消化道肿瘤，我国食管癌发病率世界排名第一，通过内窥镜检查确诊食管癌的患者比例非常低，而且很多患者由于各种原因也不愿意进行内窥镜检查，因而导致确诊食管癌患者大部分处于中晚期，整体生存率较低。英国研究人员在伦敦的3家医院招募了335名患者，其中食管癌患者163人，对照组172人（患有其他良性疾病或者正常）。

患者需要向一个容器中吹气，收集大约500mL，结果显示，呼吸测试能以85%的准确性从包含良性疾病的样本中检测出食管癌患者。我国科研人员研制的呼气质谱设备，在几分钟之内，可以完成样品检测、结果判定，通过对特征离子的检测和模式识别，可以实现对宫颈癌、肺癌、食管癌的判别。

除了感染性疾病和癌症早筛，也有学者采用质子转移反应质谱(PTR-MS)开展高血糖和尿素氮偏高两类人群呼气标志物研究；采用二次电喷雾电离离子源技术和质谱实时分析呼出气体代谢物，用于慢阻肺早期诊断。

丙泊酚的理化特性可以使它通过肺泡毛细血管膜进行弥散，也为进行监测丙泊酚的肺清除提供了可能。经过大量实验，发现呼气末气体中的丙泊酚可以进行测定，并且可以较好的反映血浆中的丙泊酚浓度，这在静脉麻醉中为实时监测动脉血液中丙泊酚的浓度和变化提供了可行性。

（小编注：另一个呼气质谱在药物动力学的重要应用是在瑞士开展的儿童癫痫药物浓度在患者呼出气体中直接测量）

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手术室里的“职业杀手”

未来呼气质谱检测有两个主要的技术发展方向，分别是以高灵敏度、高分辨率、高准确性为特征的精密呼气质谱仪，以及小型化、专用性、快速检测为特征的便携呼气质谱仪。

精密呼气质谱仪将联用气相色谱技术，结合呼气组学及一系列机器学习算法用来对人体呼气进行精准检测。需要使用专用的呼气采集设备配合完善且标准的采样流程进行质谱检测分析。具体应用场景可以是临床检验科、第三方检测实验室等，检测结果相比血检具有无创和便捷性优势，同时能够提供额外的特征信息，对呼吸道、以及多种脏器的慢性疾病具有显著的特异性和准确性，为临床提供更加灵活的检测手段和方法。（小编注：这里的精密呼气质谱仪也包含PTR-MS为代表的快速质谱仪，相对于气相质谱小时级别的分析速度，快速质谱秒级的出数速度在人口流动较大等样品较多的应用场景下会更加适用。）

便携呼气质谱仪将结合一次性吹气（或者采样）耗材，对人体呼气样本进行在线检测。便携呼气质谱仪在仪器硬件性能上会降低灵敏度、分辨率等指标，但以其便携灵活的特点可以在诸如司法、急诊、公安等场景发挥巨大优势。此外相比离线检测，便携式质谱仪由于能够对人体呼气进行在线检测，因此对于人体呼气过程不同阶段的具体分析能力是其独有优势。

我国是人口大国，国内相关企业推动呼气质谱快速发展在数据积累方面具有较大本土优势，在获取临床样本环节相比发达国家成本低、效率高，目前我国企业及院校在呼气质谱临床检测领域已经积累一定的技术，并取得可喜的应用成果。然而有些呼气质谱相关技术的研究主要是在质谱技术基础上额外增加了主成分分析以及非监督判别等机器学习领域的基础数据处理技术，在得到看似较高准确性和特异性的表象下隐藏着对仪器设备、采样流程、检测方法等全流程环节稳定性的高度依赖，一旦漫长的采样、收集、检测某一个环节有微小扰动，则整套算法和历史数据将无法适用，这也是未来呼气组学类设备走向市场所面临的关键障碍。

解决以上问题的一种思路就是通过对人体代谢过程分析，准确确定某些疾病与其高度特异性的标志物VOC分子的对应关系，减少数据分析过程对于仪器设备的依赖。在现有的技术中，GC-MS提供了关于呼出气体中挥发性有机化合物的定性和定量的高度特异性信息，使该技术成为发现并确认VOC标志物的金标准。（小编注：从整体来看，GC-MS和快速质谱其实在呼气分析方向是搭配的，且结果和应用是可以相互补充的。一是GC-MS提供的特异性物种可以做为快速质谱在现场应用的指导，二是快速质谱，尤其是搭配高分辨率质谱的，可以在现场大批次样品的分析中，对某些有规模的组分进行非靶向分析，得出信息后指导后续实验室GC-MS进行进一步验证分析）

此外为了确保检测的准确性，可以将梯度浓度的VOC气体标准样品作为质控样品，在每天检测样本前对仪器参数进行校准，同时检测环境的数据有助于将环境与呼气的VOC信号进行有效区分，通过背景扣除从而进一步优化数据质量。小编注：这是一个非常重要，但却经常被忽视的观点。志愿者和其他实验人员所在环境空气的测量和后续对算法效率的考量值得更高的重视度，尤其是在实验设计阶段。例如不管在进行呼气样品采样或者呼气实时在线分析，志愿者们不仅仅需要位于同一个环境中，或条件可控的类似环境中，同时也需要给予充分时间以达到平衡。）

目前呼气质谱检测的样本采集方式常见气体收集袋的方式，样本VOCs浓度较低或仪器检测灵敏度不能满足直接采样测试时，通常采用热脱附管对VOCs进行吸附富集，以提高分析精度。这两种样本采集技术在环境气体VOCs检测时能够较好发挥作用，但是在呼气检测时则遇到多种麻烦。气体收集袋无法实现浓缩富集对于灵敏度提升效果不佳，此外收集人体呼气过程中在收集袋内表面的冷凝水将吸附大量挥发性有机物，使检测信号更加微弱；环境检测领域采用热脱附管的方案通常有气泵进行稳定的、长时间富集过程，然而这种方法在呼气采样时难以实现，此外人体呼气中存在大量气溶胶颗粒，可能包含蛋白、核酸、固体颗粒甚至病毒，采用热脱附管的重复采样很容易造成污染而影响检测，严重时甚至会造成交叉感染。没有可靠的采样方式，很难保证检测数据的可靠性，因此对于呼气质谱检测项目来说，设计标准化程度高、一致性好、安全可靠、能够排除环境干扰的样本采集方案是当前需要解决的重要问题。