国自然热点: 一文 get 细胞衰老标志物及检测方法！
2023-11-06 14:28:25, 小 M
上海皓元生物医药科技有限公司
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小到细胞，大到个体，都免不了生老病死。自两千年前秦始皇研究仙丹以来，“衰老” 便是从古至今的研究热点。那“细胞衰老 (Cellular Senescence)”是否等于“衰老 (Aging)”呢![]()
？哈哈哈，作为 “科研汪”，你是不是犹豫了？不急，咱们往下看细胞衰老是指细胞处于一种稳定的细胞周期停滞的状态，此时细胞无法正常增殖。细胞衰老只是衰老的标志性事件之一，并不能等同于衰老。随着年龄的增长，人体内的衰老细胞会日渐累积。多种因素均可诱发细胞衰老。内在因素：癌基因的激活，氧化应激，基因毒性应激 ，线粒体功能障碍等。外在因素：辐射和化疗药物。这些都可通过引起 DNA 损伤 (DNA damage)，激活 ATM/ATR 激酶和 p53/p21CIP1 信号轴，最终导致细胞周期阻滞，诱发衰老[1]。![]()
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万变不离其宗，细胞衰老，诱因颇多，但途径可概括为三种：激活 DNA 损伤反应 (DDR)、端粒功能紊乱、癌基因的激活，进而引起细胞周期停滞，导致衰老[2]。![]()
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图 2. 诱发衰老的机制和特征[2]
1. 激活 DNA 损伤反应 (DDR)：这是最常见的诱发衰老的途径，其会导致 γH2AX、53BP1 和 MDC1的磷酸化，并进一步磷酸化 ATM、ATR，以及下游激酶 CHK2、CHK1，最终激活 p53，引起细胞周期停滞。
2. 端粒功能紊乱：染色体末端的端粒缩短 (Telomere shortening) 或者缺乏端粒酶也会影响 DNA 复制，诱发 DNA 损伤反应，引起细胞周期停滞。
3. 癌基因的激活：致癌基因激活是细胞衰老的强大诱导剂。癌基因 (如 Ras 家族) 的过度激活会诱导活性氧 (ROS) 产生，导致细胞过度增殖、复制压力和 DNA 损伤。该阶段本质上与发生紊乱的 DNA 复制相关，最终参与 DDR 通路并导致衰老。
细胞衰老后，其表型也将出现诸多变化。如图 2 所示，形态上，细胞异常增大，呈扁平状。细胞周期出现阻滞，ROS 上调，衰老相关 β-半乳糖苷酶 (SA-β-gal) 上调，衰老相关异染色质簇集 (SAHF) 形成，并具有衰老相关分泌表型 (SASP)。此外，还会出现 BCL-2 水平上调和 DDR 的激活[2]。
Get 了细胞衰老的相关知识，那么问题来了，细胞衰老要如何检测呢？对头对头，标志物！我们可以通过衰老细胞的标志物来检测衰老细胞。常见的检测方法有细胞染色，Western blot，PCR 和 ELISA 等。小 M 已经为大家贴心地整理好啦，请查收 ！
表 1. 细胞衰老特征、标志物及检测方法[3][4]
说完干货，怎么能不实战一下？下面，小 M 就带大家一起看看几个具体的检测案例~
▐ C 位大咖：SA-β-Gal
SA-β-Gal，一种广为人知的衰老标志物，可谓“大咖” 级别。为探究抑制 p300 活性与衰老诱导的相关机制，Alexandre Prieur 等人在 hTERT 永生化 HDF 细胞系 TIG3 (et) 和 BJ (et) 细胞模型中，使用 Curcumin 抑制 p300 HAT 活性，并通过 SA-β-gal 试剂盒检测了细胞衰老 (SA-β-gal 可以将试剂盒中的底物 X-Gal 催化生成蓝色沉积物，在光学显微镜下即可观察)，SA-β-gal 活性增加 (图 3)[5]。
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图 3. TIG3 细胞经 Curcumin 处理后 SA-β-gal 活性变化[5]
同时，作者使用 Curcumin 诱导 TIG3 (et) 细胞衰老后，检测了增殖相关的标志物 EdU，验证了细胞增殖停滞。EdU 是一种核苷酸类似物。在 S 期时用 EdU 标记细胞，细胞正常增殖时进入 G2 期和 M 期，DNA 复制物被分配到两个新细胞中，因此每个细胞中 EdU 会随细胞分裂而减少，而当细胞周期阻滞时，EdU 继续保留在 DNA 链中，EdU 信号不变[5]。![]()
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图 5. 免疫荧光法检测 TIG3 细胞中 EdU 信号 (S 期标记) 在 Curcumin 缺失/存在 1 h/15 d后的变化[5]
除了检测 SA-β-Gal 外，细胞周期调节蛋白也是常用的检测标志物。为了表征致癌基因 ras 对细胞周期阻滞的影响，Manuel Serrano 等人在 IMR90、MEF、REF52 三种细胞表达了一种激活的 ras 等位基因 (H-ras V12)，检测到 P53, P21 和 P16 的上调，证明细胞发生了衰老 (抗体放送: P16 Antibody, p21 Antibody, p53 Antibody)[6]。
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图 6. 免疫印迹法检测不同细胞经衰老诱导 (表达 H-ras V12 逆转录病毒) 后细胞周期调节蛋白变化[5]
此外，还可以检测 DNA 损伤相关标志物——γH2AX。在癌症中，异染色质水平往往高于正常组织，为了研究异染色质的扰动对癌细胞 (致癌基因激活) 的影响，Raffaella Di Micco 等人在 HCT116 细胞 (携带 K-Ras 激活突变) 中，使用 Valproic acid sodium 抑制 HDAC，扰动异染色质，并检测到了 γH2AX 及 cleaved caspase-3 的积累，证实了衰老的发生[7]。
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图 7. 免疫印迹法检测 Valproic acid sodium 诱导 HCT116 细胞 γH2AX 积累[7]
最后，衰老相关分泌表型 (SASP) 也是一种常见的检测指标。SASP 包括有细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外基质 (ECM) 蛋白酶等，其中，促炎因子 IL-6 与 IL-8 较为常见。敲黑板！敲黑板！虽然细胞衰老标志物多种多样，但衰老细胞表型和功能均具有高度异质性，可能因应激源和所研究的细胞/组织/疾病类型而异，因此，小 M 在此提醒大家在检测衰老细胞时，应根据自己的实验模型，多参考文献再进行研究。
前文说到，衰老细胞在多种疾病或衰老过程中都有所积累，目前，靶向清除衰老细胞的策略 (Senolytics) 可谓是炙手可热的治疗方法。其原理是通过干扰衰老细胞信号通路来抑制衰老细胞抗凋亡通路 (SCAP)，从而选择性清除衰老细胞。主要的抗凋亡通路包括 Hsp90，Bcl-2 family proteins，P53，PI3K/Akt/mTOR 信号通路等。目前，已有多种抗衰老药物用于临床研究，如 Dasatinib, Fisetin, Quercetin 等，适应症包括特发性肺纤维化，慢性肾脏疾病，阿尔兹海默症，骨关节炎等[8]。
除此之外，还有 SA-β-Gal 激活型的半乳糖包被的纳米粒子前药策略，基于衰老细胞表面的特定受体的 CAR-T/Vaccine/ADCs 疗法，以及干扰 FOXO4-p53 结合的促凋亡多肽 FOXO4-DRI 等[8]。
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图 8. Senolytics 策略和药物[8]
本期小 M 为大家介绍了细胞衰老的诱发因素、衰老的机制及检测方法。虽然衰老细胞标志物涵盖细胞周期阻滞，DNA 损伤，代谢、形态变化，衰老相关分泌表型，凋亡阻滞等多个方面，但其表型和功能具有高度异质性，我们在实验过程中选择检测指标和方法时可要多参考大牛们的文献！PS：小编也期待有一天科学家们能开发出越来越多的优秀 Senolytics 分子，让小编能延缓衰老，健康变老~| 2,500+ 化合物，涵盖 Sirtuin、mTOR、p53、Telomerase 等多种靶点。 |
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| 高活性 Src/Bcr-Abl 抑制剂，诱导凋亡和自噬，抗肿瘤试剂。 |
| 天然抗氧化/抗炎剂，可激活 SIRT1，抑制 PI3K 等。 |
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| Nrf2 抑制剂，抗炎/抗癌试剂，诱导细胞凋亡和周期停滞。 |
| p300/CREB 抑制剂，抗炎/抗氧化/抗增殖/抗血管生成试剂。 |
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1. Nicolás Herranz, Jesús Gil, et al. Mechanisms and functions of cellular senescence. J Clin Invest. 2018. 128(4):1238-1246. 2. Raffaella Di Micco, Fabrizio d’Adda di Fagagna, et al. Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021. 22(2):75-95. 3. Fafián-Labora JA, et al. Classical and Nonclassical Intercellular Communication in Senescence and Ageing. Trends Cell Biol. 2020 Aug;30(8):628-639. 4. Bulbiankova D, Rocío Díaz-Puertas, Francisco Javier Álvarez-Martínez, María Herranz-López, Enrique Barrajón-Catalán, Vicente Micol, et al. Hallmarks and Biomarkers of Skin Senescence: An Updated Review of Skin Senotherapeutics. Antioxidants (Basel). 2023 Feb 10;12(2):444. 5. Alexandre Prieur, Jean-Marc Lemaitre, et al. p53 and p16(INK4A) independent induction of senescence by chromatin-dependent alteration of S-phase progression. Nat Commun. 2011. 2:473. 6. Serrano M, Lowe SW, et al. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 1997 Mar 7;88(5):593-602. Cell. 1997. 88(5):593-602. 7. Raffaella Di Micco, Fabrizio d''Adda di Fagagna, et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 2011.13(3):292-302. 8. Selim Chaib, Tamar Tchkonia, et al. Cellular senescence and senolytics: the path to the clinic. Nat Med. 2022. 28(8):1556-1568.
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？哈哈哈，作为 “科研汪”，你是不是犹豫了？不急，咱们往下看
