ADC药物的质量控制和药代PK

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ADC的制造

基本要求：

ADC的制造主要包括单抗制备、连接子制备、小分子药物制备、ADC偶联、纯化及成品生产等过程。连接子和小分子药物可能会作为连接子-小分子药物中间体生产，在这种情况下，连接子和小分子药物的要求也适用于其连接子-小分子药物中间体。ADC具有复杂的质量属性，应在充分了解质量属性及临床应用目的的基础上，以“质量源于设计”和“风险评估”等原则和理念，确定相应的生产工艺和质量控制策略。对每一步工艺步骤进行充分开发和优化（如采用Design of Experiment，即DOE的方式），根据对关键质量属性的影响确定关键工艺步骤和工艺参数范围，并通过建立有效的“质量管理体系”，保证制品的安全性和有效性。

生产用原材料的控制

单抗

ADC的单抗生产及控制应依据“人用重组单克隆抗体制品总论”及“人用单克隆抗体质量控制技术指导原则”，采用现有先进的分析手段，从物理化学、免疫学、生物学等角度对制品进行全面的分析，并提供尽可能详尽的信息，以反映目标产品的质量属性。抗体特性分析至少包括理化异质性、结构完整性、氨基酸序列、高级结构、糖基化修饰、二硫键、生物学活性和免疫学特性等。

连接子2.3.2.1 连接子的制备

适用于化学全合成或半合成的连接子的研制，研制工艺应可控、稳定，能够实现工业化生产，同时，保证产品质量的稳定性和批间一致性。连接子的质量，如正确的结构、纯度及杂质种类等会影响其与单抗或小分子药物的连接，应针对关键工艺参数进行充分的研究，可参考《化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则》和ICH Q11中的相关内容进行。研究的基本内容包括工艺的选择、工艺参数的控制、起始原料和试剂的要求、工艺数据的积累、工艺的优化与放大、杂质的去除和控制等。

起始原料应根据对连接子或连接子-小分子药物质量的影响程度以及工艺研究结果制定相关质量要求。对由起始原料引入的杂质及异构体，必要时应进行相关的研究并提供质量控制方法；对具有手性的起始原料，应对对映异构或非对映异构杂质进行监测，并在充分认识工艺后确定适当控制点和可接受限度。

连接子的质量控制

连接子的质量控制应按照产品工艺特点和终产品质控的需要合理选取质控项目并设定限度。通常质控项目应包括外观性状、结构确证、理化性质（如熔点、沸点、比旋度、溶解度等）、纯度检查（如有关物质、异构体）、含量测定、细菌内毒素、有机残溶测定等。针对含有手性中心的连接子，应根据相关要求进行手性研究。对未知杂质应进行限度控制。另外，连接子的稳定性研究也非常重要，为其拟定的保存条件和有效期提供依据。

小分子药物

1）小分子药物的制备

适用于化学全合成或半合成以及从动物、植物、微生物中提取的小分子药物的研制。研制工艺及要求与“连接子的制备”基本一致，可参考《化学药物原料药制备和结构确证研究的技术指导原则》和ICH Q11中的相关要求。另外，考虑到小分子药物及试剂等的毒性，应安放相应的防护设备，并制定相应的防护和应急处置措施，同时，应有废弃物的处理方案。

2）小分子药物的质量控制

应根据小分子药物的结构特征、理化特性和最终产品的质控需要制定相关质控策略，考虑包括制备过程所用的起始原料及试剂、制备中间体及副产物，以及有机溶剂等因素对最终产品质量的影响。应对小分子药物、连接子-小分子药物进行化学结构和组分的确认，并在其基础上进行相应的质量研究。结构确证研究可包括红外、紫外、核磁共振（碳谱、氢谱，必要时进行二维相关谱）和质谱等研究。质量研究应包括性状、鉴别、检查和含量测定等几个方面。应重点关注可偶联杂质和手性异构体，对未知杂质进行限度控制。对于含有手性中心的小分子药物，应对其起始物料及合成中间体进行质量控制，并根据需要对终产品进行手性异构体分析研究。另外，小分子药物的稳定性研究也非常重要，可为其拟定的保存条件和有效期提供依据。

性状

对其外观进行描述，包括状态（如固体、液体）和颜色。若任何一种性质在贮藏时发生变化，应进行调查，并采取相应的措施。对具有光学活性的小分子药物，还应根据情况考虑进行旋光度或比旋度测定。

鉴别

应采用专属性强、灵敏度高、重复性好和操作简便的方法，常用的方法有化学反应法、色谱法和光谱法等。

检查

通常应考虑小分子药物对ADC安全性、有效性和稳定性三个方面的影响。检查项目可考虑一般杂质（如：氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐、炽灼残渣等）、有关物质、溶剂残留、晶型、干燥失重或水分、异构体等。在既定的工艺生产和正常贮藏过程中可能产生需要控制的杂质，包括工艺杂质、降解产物、异构体和残留溶剂等，因此，要进行充分的质量研究，并结合最终产品需要制定小分子药物的杂质控制项目。

含量测定

在适宜开发阶段，可选择专属性强，精密度、准确性良好，能反映产品稳定性的方法测定其含量。

生产过程的控制

ADC的生产过程较为复杂，为保证最终得到质量可控、批次间一致性较高的产品，应对关键原材料设置质量标准和有效期规定，包括单抗、连接子和小分子药物。如需贮存中间产物，应对中间产物的贮存条件进行相应的稳定性研究。

单抗生产

单抗的细胞培养和收获、纯化和原液生产的要求均可参照“人用重组单克隆抗体制品总论”。

ADC偶联工艺

1）抗体结构修饰

抗体通过生物或化学反应，形成特定的活化基团以便后续的偶联反应即为抗体的结构修饰。抗体与小分子药物的偶联分为非定点偶联和定点偶联。非定点偶联通常是通过抗体分子上赖氨酸的氨基或半胱氨酸的巯基与小分子药物连接；而定点偶联则是通过对抗体分子进行修饰改造，如在特定位点引入半胱氨酸或包含特殊结构的非天然氨基酸，也可通过生物酶将特定氨基酸脱糖等形成特异的偶联位点，从而将小分子药物连接到抗体的特定位点上。

根据反应类型不同，应考察反应体系中的不同指标，如反应浓度、投料量、温度、时间、缓冲体系、pH、有机助溶剂种类或用量等对终产品的影响，设定合理的中控检测（如细菌内毒素等），制定合理的工艺控制范围，通过不断积累确定最终工艺条件。另外，在工艺开发的合适阶段还应对反应体系与容器的相容性进行研究。

2）偶联反应

通过生物或化学反应，将小分子药物与抗体上的活性基团进行连接形成完整ADC分子的过程即为偶联反应。与抗体结构修饰的过程要求一致，应考察反应体系中反应浓度、投料比例、温度、时间、缓冲体系、pH、有机助溶剂种类与用量等参数对终产品的影响，设定合理的中控检测（如DAR、SEC、细菌内毒素等），制定合理的工艺控制范围，通过不断积累确定最终工艺条件。另外，在工艺开发的合适阶段还应对反应体系与容器的相容性进行研究。

3）ADC提取和纯化

制品的提取和纯化应采用证明能够有效去除偶联反应中工艺相关和制品相关杂质的工艺进行。工艺相关杂质，包括残留的还原剂、氧化剂、催化剂、反应酶、有机溶剂等；制品相关杂质，包括游离的连接子、小分子药物、连接子-小分子药物中间体、未偶联抗体和ADC聚合体等。此外，还应注意控制工艺过程中的微生物污染（如细菌内毒素等），并在工艺开发的合适阶段评估纯化缓冲液与接触材料的相容性。

4）ADC原液

纯化后的ADC经处方配制和过滤后分装于中间储存容器中，即成为ADC原液。原液贮存应注意研究原液与容器的相容性、原液的稳定性及保存时间，并确定贮存条件和有效期。

5）ADC成品

原液或半成品经除菌过滤后分装于无菌终容器中并经包装后即为成品。将分装后的无菌容器密封，以防污染，如需冷冻干燥，先进行冷冻干燥再密封。

质量控制

ADC具有比单抗更复杂的结构和更特殊的质量属性。质量控制策略应基于对关键原材料（单抗、连接子、小分子药物等）的质量评价、对终产品关键质量属性的理解以及对工艺认识的不断积累，结合风险评估手段综合制定。

1）单抗质量控制

参考“人用单克隆抗体质量控制技术指导原则”及“人用重组单克隆抗体制品总论”相关技术要求。一般情况下，必须对抗体进行充分鉴定。应根据关键质量属性、对单抗质量和工艺理解认识的积累以及风险评估的原则，制定适当的质量控制策略。另外，还需对可能影响偶联工艺的质量属性进行充分的研究和适当的控制。

2）ADC质量控制

特性分析

ADC的全面特性分析应采用适宜的、先进的分析技术，从理化性质、免疫学特性、生物学活性和杂质等角度进行全面细致的分析，并结合对裸抗的特性分析充分了解偶联前后的相关特性变化，提供尽可能详尽的信息以反映终产品的质量属性，同时，为制品质量标准的建立提供依据。特性分析至少应包括以下范畴：

理化性质

单抗通常具有复杂的异质性（如糖基化和其他翻译后修饰等）。单抗本身的异质性及偶联造成的异质性的叠加会导致ADC的复杂程度大幅提高。对于具有高度异质性的ADC（即使是利用定点偶联技术的产品），需采用具有足够分辨率的可靠分析方法进行全面分析，以阐明制品相关物质的多样性。应根据小分子药物和连接子的化学性质、偶联方式（氨基偶联、巯基偶联、定点偶联等）以及产品的复杂性选择合适的特性分析方法。

ADC的理化性质分析通常包括评估偶联工艺对抗体一级结构的影响、确定药物主要偶联位点、药物抗体偶联比（DAR）和药物载药量分布、分子大小变异体、电荷变异体以及高级结构分析等。

一级结构和药物偶联位点

采用适当方法，如肽图谱法和质谱分析法，评估偶联工艺对单抗一级结构（如氨基酸序列完整性、二硫键连接）、糖基化修饰和翻译后修饰等的影响。如果采用的偶联工艺过程已证明不会影响糖基化修饰，则偶联后的ADC可以不重复进行糖基化修饰相关特性分析。此外，还可利用质谱法对ADC中小分子药物与单抗的主要偶联位点进行鉴定和分析。

DAR

DAR是ADC重要的质量属性之一，直接影响其安全性和有效性。它表示每个抗体分子上偶联的小分子药物的平均数量。根据连接子、小分子药物的化学性质以及偶联方式选择分析手段，常用的方法包括紫外-可见分光光度法（UV）、疏水色谱法（HIC-HPLC）、反相色谱法（RP-HPLC）、质谱法（MS）等。

药物载药量分布

ADC，尤其是采用非定点偶联方式的ADC，通常是包含了连接不同数量小分子药物的ADC分子混合物。药物载药量分布表示偶联有不同数量小分子药物的ADC分子分别占总的药物分子的比例。应采用适当方法，如疏水高效液相色谱（HICHPLC）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）、毛细管电泳（CE）或质谱法（MS）等，鉴定不同载药量组分的分布（如，含有0、1、2、……、n个药物的抗体组分）。

分子大小变异体

与人用单抗产品相同，应采用适宜的方法，如分子排阻色谱法（SEC-HPLC)、非还原型和还原型十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、十二烷基磺酸钠-毛细管凝胶电泳（CESDS）和分析型超速离心（AUC）等多种方法对ADC的分子大小变异体（即聚合体和片段）进行适当鉴定。需要特别关注聚合体，因为许多与抗体偶联的小分子药物具有较强的疏水性，可能会增加生产和贮藏期间聚合体的形成。

电荷变异体

对于单抗，通常采用毛细管区带电泳（CZE）、离子交换色谱（IEX-HPLC）、毛细管等电聚焦电泳（CIEF）或成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）等适当方法测定电荷变异体。这些方法对ADC分析的适用性取决于连接子-小分子药物的特性（尤其是电荷）以及偶联位点的选择（如赖氨酸、链间巯基、碳水化合物等）。虽然IEXHPLC法是测定抗体电荷变异体的常用方法，但由于小分子药物多位点连接的可能性以及与色谱柱固定相之间潜在的非特异性相互作用，该方法可能不适用于非特异性偶联ADC电荷变异体的分析。

在某些情况下，通过赖氨酸残基偶联ADC的电荷异质性分析可能不可行或无意义。例如，通过赖氨酸残基连接不带电荷的连接子-小分子药物后，每连接一个连接子-小分子药物会导致ADC的净正电荷减少一个。在这种情况下，基于电荷的分离方法只能分析赖氨酸偶联的ADC的载药量图谱，而无法反映单抗药物本身的电荷异质性。采用其它表征方法（如肽图谱）来评估偶联对抗体本身电荷异质性的影响可能更有意义。

高级结构

蛋白质的高级结构由氨基酸序列和翻译后修饰共同决定的，因此，蛋白质一级结构的确证是研究其结构特性的基础。用来直接评估ADC分子共价结构的理化方法详见“3.2.1.1.1”节~“3.2.1.1.5”节。

传统的生物物理学方法如圆二色光谱（CD）、差示扫描量热法（DSC）、动态光散射（DLS）和傅里叶变换红外光谱法（FTIR）等可用于鉴定ADC的生物物理学性质。然而，由于抗体或ADC为生物大分子，往往限制了上述方法（如CD和FTIR）检测结构异质性的能力，达不到理想的灵敏度。在研究ADC产品时，其各组分的存在可能会使结果分析复杂化。

此外，ADC的高级结构还可通过生物学功能确证（“3.2.1.2”节）。生物学活性是对高级结构的确证，其它能够反映产品功能活性的体内或体外生物活性检测方法，也可以作为高级结构的补充确证方法。

免疫学性质和生物学活性

对于ADC产品，应采用适当方法（如ELISA或表面等离子体共振法等）来评估偶联对抗体免疫学性质（如抗原结合活性）的影响。ADC应保持其与目标抗原结合的特异性及各批次之间结合活性的一致性。

ADC的主要作用机制是通过抗体与细胞外靶抗原结合，被细胞内吞，然后利用小分子药物杀死细胞。应通过细胞杀伤测定法证明靶点依赖性细胞毒性（生物学效应），对该作用机制进行证实。

对于抗体，Fc介导的效应子功能可能在作用机制中起作用并对产品安全性和有效性产生影响。对于ADC，由于与细胞内吞的竞争效应，Fc介导的效应子功能可能对抗肿瘤作用无显著影响。但是，如果Fc介导的效应子功能显示有可能与ADC的临床活性相关，则应进行基于细胞的生物活性测定或其它可以反映效应子功能的测定。

工艺相关杂质和污染物

1）工艺相关杂质

应鉴定潜在的工艺相关杂质（如游离小分子药物及其相关物质、残留溶剂及重金属等），并根据情况进行定性和/或定量评价。对于ADC中残留游离小分子药物的测定可以先沉淀蛋白质（包括ADC分子上偶联的小分子药物），然后采用能够检测小分子药物的方法分析上清液中残留的游离小分子药物，也可采用其它样品制备方法。游离小分子药物残留量应结合相关小分子药物的药理毒理特性及药物最大使用剂量，设定合理的限度标准。

2）污染物

应严格避免和/或适当控制污染物，包括所有偶然引入的、且不属于生产工艺预期使用的物质（如微生物、内毒素等）。

3）含量

建议采用适宜的物理、化学或免疫学方法测定含量。如测定ADC的消光系数后，采用分光光度法在280 nm处测定蛋白浓度。对于ADC，除多肽骨架外，还应考察小分子药物或连接子-小分子药物对280 nm处吸光度测量值的潜在贡献，如发现明显干扰，在供试品浓度计算中应纳入适当的校正因子。

4）制品检定

与其他人用重组DNA蛋白制品相似，ADC原液及制剂的检定需要考虑其鉴别、纯度、含量和效价等。然而，由于ADC的结构复杂性以及小分子药物的存在，需要特别考虑某些特定的性质，某些主要源于抗体的质量属性（如糖基化和其他翻译后修饰等）应在抗体的生产和检定时进行适宜的控制。

ADC常规放行质量控制项目与可接受限度，应结合代表工艺的多批次样品的数据、生产批次间一致性的数据以及稳定性研究数据等综合确定。ADC制品的质量检定应至少包括以下项目。

5）鉴别

鉴别检查方法应基于产品分子结构和/或其他特性的高度专属性。鉴别检查方法必须对ADC产品具有足够的专属性，以证实其产品含有两种必需成分（抗体和小分子药物）。基于产品特性，可能需要采用一种或多种理化、生物学和/或免疫化学检查方法进行鉴别。

6）DAR和药物载药量分布

应测定DAR，并设定可接受标准，检测结果应在规定范围内。另外，还应包括药物载药量分布特征的定性评估。

7）纯度和制品相关杂质

如特性分析章节所述，ADC可能具有复杂的纯度/杂质特征，需要通过正交组合的方法进行评估，并确定制品相关变异体的单独和/或总体可接受标准。

通过精确和可靠的方法测定分子大小变异体，以测定ADC中的聚集和片段化程度。如果可能，还应采用适当方法测定电荷变异体。

工艺相关杂质

在控制策略中，应包含工艺相关杂质的控制方法。在某些情况下，经合理论证后可以在适当步骤中对偶联工艺中的关键杂质进行检查以达到杂质控制的目的。

游离小分子药物和偶联溶剂残留的质量控制通常会纳入制品质量标准中，检查结果必须符合规定的限度。

效价

效价是一个基于产品生物学特性的定量测定指标。效价测定应包含在原液和制剂的质量标准中，效价测定方法应尽量反映临床相关的生物学活性。

应根据ADC的作用机制，建立基于细胞杀伤的ADC生物学活性测定方法，以证明其具有靶点依赖性的细胞毒性。如靶点结合测定法（如ELISA、表面等离子共振等）可提供更多的产品质量信息，在经过验证后也应将其纳入常规放行检验。

每批原液和制剂的效价均应采用适当的国家标准品、国际标准品或参比标准品来确定。尚未建立国家或国际标准品的，应采用经批准的经过充分表征分析的内控参比品。标准品和参比品的建立及制备均应符合“生物制品国家标准物质制备和标定规程”。

含量

应采用适宜方法测定原液和成品的含量。

安全性试验

无菌、细菌内毒素和生物负荷检查应符合要求，参见“人用重组单克隆抗体制品总论”相关要求。异常毒性检查应结合ADC的毒理学数据和临床给药剂量，评估该项检查的适用性、合理性和可操作性。

其它检测项目

应合理评估外观（例如性状、颜色、澄清度等）、可见异物、pH值、渗透压、装量/装量差异、不溶性微粒等，冻干制剂还应考虑复溶时间、水分等。

稳定性评价、储存和有效期

ADC稳定性评价应依据《生物制品稳定性研究技术指导原则》要求进行，并应符合“生物制品贮藏和运输规程”规定。稳定性评价的类型包括长期稳定性、加速稳定性及强制稳定性，由于长期稳定性的研究条件为ADC产品的实际储存条件，其间出现的降解途径和降解产物（包括单抗部分和小分子药物部分）也是产品中真实存在的，因此是最基本的稳定性研究。储存条件和有效期的设定应根据长期稳定性研究的结果进行合理设定。产品应在规定的环境条件下贮存和运输。自生产之日起，按批准的有效期执行。

ADC的药代动力学（PK）评价

由于ADC结构的复杂性、多样性，以及生物样本中释放的小分子药物含量较低等特殊性，给药代动力学研究带来了诸多挑战，主要体现在药代动力学特征、药动-药效相关性、目标分析物质、生物分析方法和数据解释的复杂性和多样性。

根据ADC特异性，建议采用相关动物种属进行单次和多次给药的药代动力学研究。当受试物ADC无相关种属或仅非啮齿动物为相关种属时，可以仅在非啮齿动物体内进行药代研究。不同种属动物间药代动力学的差异，对预测毒性试验的量效关系有明显差别。具体试验应根据药物特征，遵循case-by-case原则开展。药代研究用ADC受试物的制剂、浓度、给药方式，应尽可能与安评试验或者临床试验用受试物一致，并在研究时进行给药制剂的浓度确认。

常用于表征ADC PK特征的分析物包括：1）完整的ADC和/或总抗体（偶联和未偶联药物的抗体即总抗体，以及至少偶联一个药物的抗体），如果抗体与ADC竞争结合靶点，那么检测抗体也具有一定的意义；2）游离小分子药物和/或裸抗。

ADC的PK研究主要考察项目包括ADC的稳定性、血药浓度-时间曲线、吸收、分布、代谢及排泄（ADME）过程。如果小分子药物是新化合物，建议综合应用体内外研究方法，定性和/或定量检测手段，对小分子药物的系统暴露量、血浆蛋白结合及排泄特征、肿瘤和正常组织的摄取/分布特征等进行详细研究。必要时，对小分子药物代谢产物进行系统暴露量、代谢产物谱、分布、脱落方式、断裂点等系统研究。可通过检测小分子药物的脱落量对ADC进行体外血浆稳定性和动物体内的代谢稳定性研究。另外，建议考虑连接子的稳定性对小分子药物非预期提前释放及其对药代和药效、毒性等的影响。

ADC的PK分析方法包括检测抗体的配体结合分析及检测小分子药物及代谢产物的LC-MS/MS等方法。有些情况下，传统检测方法难以满足ADC中抗体分子准确生物分析和小分子药物体内浓度分析低检测限的需求，需要应用有效的、高灵敏度和宽线性检测范围的生物分析方法，评价ADC在体内稳定性和代谢特征。ADC生物分析方法建立和验证时需要考察DAR对检测结果的影响，必要情况下监测体内DAR动态变化。建议在ADC的药代动力学研究中伴随开展ADA检测，以辅助解释药代研究数据。