提高孢子/花粉分类水平的另一种方法——荧光寿命成像(FLIM)

陆生植物在陆地环境中作为独立的有机体产生单倍体孢子/花粉。孢子/花粉可以记录当时的生态环境和气候变化。通过对孢子/花粉的研究，可以了解古植物的种类、演化和分布情况，推测当时的植被类型和覆盖范围等。这些信息可以用于研究古生态系统和古生物地理分布，为地球的生命演化研究提供重要证据。

孢子/花粉的外壁主要由孢粉素组成，在地质时间内化学性质稳定。由于其耐酸碱，抗分解等特性，利用化学手段对孢粉素物质构成解析困难。孢粉素壁的形态学研究是孢粉学中进行孢子/花粉物种分类的经典方法。一方面，利用光学显微镜、扫描电子显微镜等手段应用于形态学研究。然而，利用形态观察的方法难以区分物种之间形态相似的孢子/花粉。另一方面，基于光谱学的手段如傅里叶变换红外/拉曼光谱等也可以提供孢子/花粉分类水平上的信息。然而，这些手段基于花粉内容物来进行种间差异分析，在孢子/花粉化石的形成时内容物消失，所以在古生物学研究中这些手段并不能在花粉分类上发挥作用。

因此，在古生物学研究中，基于孢粉素的不同孢子/花粉物种种间差异分析目前仍然是棘手的问题。

2023年7月10日，上海师范大学杨仲南团队及中国科学院南京地质古生物研究所毛礼米团队合作在Review of Palaeobotany and Palynology发表题为Fluorescence lifetime imaging of sporopollenin: An alternative way to improve taxonomic level of identifying dispersed pollen and spores 的研究成果。该工作利用荧光寿命成像(FLIM)方法研究孢粉素荧光寿命，发现FLIM可以作为提高孢子/花粉分类水平的一种方法，可以区分同一属内形态极为相似的花粉，在古植物学和孢粉学中具有极大的应用潜力。

在这项工作中，研究团队收集了栽培稻花粉粒 O. sativa来研究孢粉素的荧光寿命，使用乙酰化处理 15min 纯化了孢粉素壁并选取最大横截面进行分析（图1A）。研究人员显示了孢粉素的荧光寿命衰减时间（图1B），并表明三种荧光团在O. sativa的孢粉素中拟合优度更佳（图1E和F）。三种荧光团显示出不同的荧光寿命和相同的位置信息（图1G），表明O. sativa的孢粉素由这三种荧光团共同组成。

为了探究孢粉素内荧光团构成在其他物种内情况，研究人员从有代表性的维管植物中收集了孢子/花粉（图2A和B）。尽管荧光衰减时间曲线各不相同，但χ² -value和方差分析表明，所有测试物种中存在三种荧光团，并且显示出相同的定位。并且，三种荧光团的荧光强度和寿命在不同物种中是存在差异的，研究人员以荧光团，τ₁、τ₂、和τ₃作为x/y/z轴绘制三维散点图，空间上展现了FLIM在不同物种的孢子/花粉分类水平上提供了新信息（图2C）。

之后在同一属内的物种中展开探究，由于栽培稻花粉粒与普通野生稻花粉的形态极为相似，研究人员测试了这两个物种花粉孢粉素中的FLIM，以研究FLIM能否用于区分来自同一属的形态相似的花粉粒（图3A）。研究人员统计分析显示了栽培稻和普通野生稻之间荧光寿命的显著差异（图3B和C）。进一步分析了栽培普通小麦和野生二粒小麦之间花粉孢粉素的FLIM（图3D），统计分析也显示了普通小麦和野生二粒小麦荧光寿命的显著差异（图3E和G）。总之，这些结果表明孢粉素的荧光寿命是区分同一属中形态相似的花粉粒的有力工具。

该项工作发展了一种研究花粉孢粉素的荧光寿命成像技术（FLIM）方法。这种分析可以在单个孢子/花粉颗粒上进行。在同一物种的花粉中，孢粉素的荧光寿命不受采集年份和地理种群的影响。进一步的分析表明，孢粉素的荧光寿命成像分析区分了相同科/属中形态相似的花粉，表明这是独立于孢粉素形态学研究的有力工具。目前的研究表明，孢粉素的荧光寿命成像与经典形态学和荧光光谱方法相结合，可以提供全面的信息来区分不同的孢子/花粉。

杨仲南团队薛景石博士和毛礼米研究员为本文的通讯作者。上海师范大学生物科学（卓越创新班）本科生胡真真为论文的第一作者。本研究由国家自然科学基金(31900165)、中国科学院战略优先研究计划(XDB26000000)和古生物学与地层学国家重点实验室(20211103)的资助。