从母乳到配方奶粉，核苷酸的作用不可替代！婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的检测

2023-08-18 10:34:56, DIKMA

DIKMA

固相萃取-液相色谱法测定

婴幼儿配方奶粉中的核苷酸含量

核苷酸是由戊糖、磷酸、含氮的碱基3种结构组合而成，研究表明：母乳中游离核苷酸的含量在5-8mg/100mL之间，因此核苷酸已经被确认为条件型必需营养物质。添加了核苷酸的婴幼儿配方奶粉对婴幼儿胃肠道的健康生长和成熟有益。《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》GB 14880-2012规定了婴幼儿配方奶粉中允许添加的核苷酸有：5′-胞嘧啶核苷酸(UMP)、5′-尿嘧啶核苷酸(CMP)、5′-次黄嘌呤核苷酸(IMP)、5′-腺嘌呤核苷酸(AMP)、5′-鸟嘌呤核苷酸(GMP)等5种，允许添加量在12-58mg/100g之间，因此建立一种准确快速测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸测定方法非常重要。

目前，婴幼儿配方奶粉中核苷酸的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱质谱法，前处理采用沉淀蛋白结合固相萃取净化。GB 5413.40-2016等只沉淀蛋白质，未进行有效净化，可能导致杂质对UMP或GMP的干扰；HLB小柱杂质去除能力弱，单一的阴离子交换固相萃取柱净化外标法造成回收率偏低，需要合适的内标进行回收率校正；液相色谱-质谱联用由于基质效应和磷酸官能团的影响，造成定量不准确。

检测方法及优势

本方法采用固相萃取净化结合液相色谱紫外检测器联用，用ProElut Nucleotide(Cat.#: 65943)乳粉中核苷酸检测专用柱净化，用Spursil C18(250x4.6mm，5μm)(Cat.#: 82006)对婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸进行定量测定，有效地消除了杂质干扰，准确度高，为婴幼儿配方奶粉中核苷酸的定量测定提供参考依据。

1、实验方法

1.1

提取

称取1g±0.005g样品于50mL聚丙烯离心管中, 加入 20mL纯水, 涡旋混合3min, 用10%乙酸水溶液调 pH到4.1, 8000r/min 高速离心3min, 将全部提取液转移至25mL容量瓶里, 用一级纯水定容至刻度线, 摇匀，待净化。

1.2

净化

取2.5mL净化液加入ProElut Nucleotide(Cat.#: 65943)乳粉中核苷酸检测专用柱(预先用3mL甲醇和3mL纯水活化), 依次加入5mL 1%乙酸水溶液和5mL甲醇清洗, 弃去清洗液, 加入8mL 30%氨水甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 将洗脱液在50℃减压蒸干, 准确加入1mL流动相超声溶解, 过0.22μm 水溶性滤膜, 待液相测定。

1.3

色谱条件

色谱柱: Spursil C18(250x4.6mm，5μm)(Cat.#: 82006);

进样量: 20μL

柱温: 40℃

流速: 1.0mL/min

流动相: 磷酸盐缓冲液(准确称取1.360g磷酸二氢钾和0.4753g四丁基硫酸氢铵, 加水溶解后, 定容到 1000mL):甲醇=96:4 (V:V)

检测波长: 254nm

2、结果与分析

2.1

提取条件的优化

采用乙酸溶液调pH沉淀蛋白, 通过调节不同pH的比较, 发现pH在4.1±0.05时沉淀效果最好, 于是选择将pH调节到4.1作为沉淀蛋白质最佳条件。

2.2

净化方法的优化

奶粉基质比较复杂, 采用C18和HLB净化效果均不理想。实验发现, 混合强阳离子固相萃取小柱对CMP和UMP保留较好; 混合弱阴离子固相萃取小柱对GMP、IMP、AMP 保留较好, 于是本研究将2种固相萃取模式结合起来, 采用复合模式ProElut Nucleotide(Cat.#: 65943)乳粉中核苷酸检测专用柱进行净化。

2.3

液相条件的优化

核苷酸是一类具有较强的极性和水溶性化合物, 迪马 Spursil C18(250x4.6mm，5μm)(Cat.#: 82006)是一款碳载量较低、耐高比例水相的色谱柱, 适合于极性较强的物质的分离, 通过实验发现该色谱柱对5种核苷酸有较好的分离保留。图1~3分别为标准溶液、样品、添加回收的色谱峰。