2023-10-09 14:13:59, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
全光谱流式细胞术是近年来发展起来的一种新型流式检测技术,因其能够解析光谱特征高度相似的不同染料而备受瞩目。通过全波长光谱解析,可以大大扩展流式实验方案的分析维度,从而可以发现传统流式检测不出来的稀有细胞和自发荧光很强的细胞亚群。
通过以下实验我们详细阐述了利用Bigfoot全光谱流式分选仪检测不同组织样本中28色小鼠免疫分型的流式结果,以及用Attune NxT流式细胞仪评估六路分选后不同细胞亚群的分选效率、纯度和回收率。
28色小鼠免疫分型方案——
高参数流式分析的重要性
免疫分型方案是利用流式细胞术鉴定、表征和区分样本中不同种类免疫细胞亚群的实验方法,主要是通过荧光标记的抗体来检测细胞表面或细胞内表达的抗原水平来实现。过去受传统流式细胞仪检测通道数量的限制,一次实验检测的抗原指标有限,不仅浪费试剂、样本和上机时间,而且还不能检测共表达的细胞亚群。例如,小鼠Ly6G是单核/巨噬细胞和粒细胞的常规检测指标,但某些T细胞也有表达,因此当淋巴细胞和髓系细胞分开检测时,通常不会研究表达Ly6G的CD4和CD8 T细胞,从而限制了对免疫功能评价的全面了解。然而利用Bigfoot全光谱流式细胞分选仪和经过优化的小鼠28色免疫分型方案可以全面、高效地分析和分选样本中的不同免疫细胞亚群。
材料和方法
01
样本制备
分别取无特定病原体(SPF)的BALB/c小鼠的脾、淋巴结、股骨和胫骨组织,用完全培养基[含GlutaMAX™ 添加物 (货号: A41923-01)的Gibco™ BenchStable™ RPMI 1640培养基; 5% Gibco™ 热灭活的胎牛血清 (货号: A5209501); 50 单位/mL Gibco™青链霉素 (货号: 15070-063)]冲洗股骨和胫骨获取骨髓样本,并用70um细胞筛网进行过滤。脾和淋巴结经研磨后分别用上述完全培养基制备单细胞悬液,并用70um细胞筛网进行过滤待用。
脾细胞和骨髓样本用Invitrogen™ eBioscience™ 10X 红细胞裂解液 (货号: 00-4300-54)裂解红细胞,之后用含100 μg/mL DNase I (Millipore-Sigma, 货号: 11284932001)的完全培养基进行洗涤,用Invitrogen™ Countess™ 3 FL自动细胞计数仪 (货号: A49893)进行细胞计数,并调整细胞浓度为1 x 10⁷ 个/mL。
02
样本染色
上述细胞先用Invitrogen™ eBioscience™ Staining Buffer (货号: 00-4222-26)和小鼠Fc Block™ (BD, 货号: 553142) 孵育5分钟后,用含5 μL/test的Invitrogen™ CellBlox™ Blocking Buffer (货号: B001T03F01) 和5 μL/test 的Invitrogen™ eBioscience™ Super Bright Complete Staining Buffer (货号: SB-4401-42)的流式抗体(表2)4°C避光孵育20分钟进行抗体染色;之后用Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Fixable Olive Viability Kit (货号: L34978) 4°C避光孵育20分钟进行死活细胞染色;最后用2% 甲醛 (BioLegend, 货号: 420801) 室温避光固定30分钟。
设门策略
在SSC-A/SSC-H点图中圈出单个细胞群
在FSC-A/SSC-A点图中去除细胞碎片
利用LIVE/DEAD Fixable Olive死活染料去除死细胞
通过指标TER-119⁺去除红细胞,并圈出CD45⁺细胞进行进一步分析
中性粒细胞共表达Ly6G 和 Ly6C
进一步分析Ly6G⁻细胞中Siglec-H和Ly6C的表达情况
实验结果
图1. 利用28色免疫分型方案鉴定和分选小鼠脾细胞的设门策略。蓝色代表顺序逻辑设门关系;绿色代表分析出的各种细胞亚群;橙色代表分选出的各种细胞亚群。
图2. 脾细胞样本中各细胞亚群鉴定和分选的流式结果。
图3. 骨髓和脾细胞中各个B细胞亚群表达情况的比较。
分选后评估
01
分选效率
分选效率是指分选仪报告的细胞数占样本中所有目的细胞的百分比。用分选的6种细胞亚群分别重复3次实验,每次分选的样本和细胞数不同,但样本中目的细胞亚群的阳性率是一致的 (MZB 细胞 = 1.5%, CD8+ naive T 细胞 = 2.5%, NK 细胞 = 2.7%, Treg 细胞 = 3.4%, T1B 细胞 = 1.9%, and DCs = 0.38%)。
图4. 分选效率评估结果。
02
回收率
回收率是指分选出的目的细胞占分选前样本中所有目的细胞的百分比。
图5. 分选回收率评估结果。
03
纯度
纯度是指分选样本中的目的细胞占所有细胞的百分比。
图6. 分选纯度评估结果。小鼠脾细胞中分选出的不同细胞亚群的纯度结果,分选前后的设门策略没有进行调整。
结论
Bigfoot全光谱流式细胞分选仪可以高维解析光谱特征相近的荧光染料,因此可以大大扩展流式多色方案,从而获得更多样本信息。通过以上28色小鼠免疫分型方案可以鉴定出20多种不同的细胞亚群,并且通过六路分选高效地分选出不同组织样本中的稀有细胞。
以下为不同小鼠细胞亚群的分型方案(上下滑动查看更多):
下面简单介绍一下本实验用到的
流式细胞仪、抗体试剂以及赛家流式培训课程
👇🏻👇🏻👇🏻
Bigfoot全光谱超高速流式细胞分选仪
——高效、准确、安全、灵活
Bigfoot是全球第一台全光谱、超高速、高性能的流式细胞分选仪,具有强大的光谱解析和分选能力,是免疫学研究和生物医药开发领域的强有力工具。
其主要技术优势如下:
配置高达9激光60参数
实时全光谱拆分及传统补偿调节模式可供选择
超高的分析和分选速度
强大的分选性能及灵活的分选模式
整合式II级生物安全柜及气溶胶管理系统
智能型全自动仪器校准及质控
流式抗体及试剂
eBioscience是全球三大知名流式抗体品牌之一,陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成功、共同成长!以FoxP3流式抗体为代表的产品深受广大科研人员的喜爱,全新推出的Brilliant Violet、Brilliant Ultra Violet和NovaFluor新型光谱染料标记的抗体每月上新,欢迎关注!
以梦为马,享学启程
Dr.赛精心准备的流式系列线上课程是帮助大家成为流式达人的宝藏资源,利用碎片时间,享学启程吧!
点击Dr. 赛可直达赛默飞生命科学学堂线上课程
12-25 Scienion
新型 KS 1000 洗涤装置|凯氏定氮分析的安全保障12-25
愿你圣诞“唯”有快乐相伴,幸福满“意”、好运“朴”照!12-25
再见了,检验检测单位!一位非编人员的十五年历程,记录一群被遗忘的检测人12-23 马大哈
「大牌云集」CBIFS第十六届食品安全技术论坛首批展商抢先看!12-23
冬至,无界创新成果至 | GE医疗首台国产超高端量子平台Revolution Apex Expert CT在北京基地下线12-22
喜报100% | 阿尔塔科技5项能力验证全获“满意”结果12-22
祝大家圣诞节快乐!!12-22
布鲁克自己都服了,6种微塑料光谱检测方法全都有!12-22
【新品发布会】美谷分子重磅发布 CellXpress.ai 全自动一体化类器官工作站12-22 美谷分子仪器
FDA重要通知解读:CAR-T治疗后的T细胞恶性肿瘤风险评估与优化前景12-22 景辉
【Webinar 预告】人类发育和疾病中的 DNA 甲基化12-22 美谷分子仪器
【Webinar 预告】类器官超全研发进展和应用趋势12-22 美谷分子仪器
喜迎双“旦”| 赛默飞色谱与质谱中国祝您双旦快乐!12-22
圣诞有你,才叫惊喜!腾龙发起宠粉活动~~12-22
叮!圣诞氛围组小可爱已上线12-22 市场部
组织图片库12-22 徕卡显微系统
圣诞将至 | 徕卡显微系统陪你温暖过冬12-22 徕卡显微系统
【工作流程】简化生物应用的电镜样品制备工作流程12-22 徕卡显微系统
【点播课程】对囊泡运输的见解12-22 徕卡显微系统