魔力剪刀手-CRISPR基因编辑技术的临床前应用研究

理论上，CRISPR可以随意对任何突变的基因进行编辑，从而治愈任何具有遗传潜质的疾病。然而，在实践中，随着技术的迭代革新，CRISPR已经突破了其主打的治疗领域，除了在目前应用较多且较为成熟的β-地中海贫血（TDT）和镰状细胞病（SCD）等疾病，还在癌症、神经退行性疾病、耳/眼科疾病、病毒感染疾病（艾滋病、新冠肺炎）以及其他遗传性罕见病如DMD、CF、ATTR等领域表现出不俗的治疗潜力。

其中，在CRISPR体外基因编辑领域进展最快的，当属CRISPR Therapeutics和Vertex公司的CRISPR编辑造血干细胞产品exa-cel，其上市申请已于今年1月底获得了欧洲药品管理局（EMA）受理，并早在去年11月已向FDA提交滚动上市申请，预计将在2023年完成提交。许多业内人士认为，exa-cel有极大希望成为首款获批上市的CRISPR基因编辑疗法。

相较于体外基因编辑，体内基因编辑疗法最突出的优势在于能够覆盖更多适应症、靶细胞和靶器官，也无需细胞分离和体外培养。目前，张锋创立的公司Editas旗下的EDIT-101是全球进展最快的体内基因编辑疗法。2022年11月，Editas公布了EDIT-101的1/2期临床试验数据：14名接受治疗的患者有3名达到了预期。EDIT-101是由 Editas开发的治疗Leber先天性黑蒙症10型（LCA10）的CRISPR基因编辑疗法。

不过，体内编辑相比体外编辑的难度更大，已有的递送系统和研究方法在实现体内基因组编辑器递送中仍面临诸多挑战。但是，前段时间引起业内热议的首个获得FDA批准用于人体临床试验的LNP递送的体内CRISPR基因编辑疗法NTLA-2002，通过脂质纳米颗粒（LNP）以mRNA形式递送CRISPR-Cas9基因编辑系统，靶向敲除KLKB1基因，以永久性降低血浆中激肽释放酶活性，从而防止遗传性血管性水肿（HAE）的发作。这种直接注射LNP递送的CRISPR基因编辑组份即可在体内进行高效基因编辑的形式，为许多遗传疾病的治疗开辟了新的途径，被誉为“开启了医学新时代”。

这项被誉为“基因魔剪”的技术，其原理并不复杂。首先，CRISPR是大多数细菌及古细菌中一种不断进化适应的免疫防御机制；而CRISPR/Cas 是原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。CRISPR/Cas 系统可以识别出外源 DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi）的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas 系统被开发成一种高效的基因编辑工具。CRISPR系统的多功能性大部分来自CRISPR相关蛋白或Cas蛋白，即识别和切割特定DNA片段的分子。

在自然界中，CRISPR/Cas 系统拥有多种类别，目前已经发现了6种主要类型和超过22种亚型的Cas蛋白，其中 CRISPR/Cas9 系统是研究最深入、应用最成熟的一种类别。现在使用的 CRISPR/cas 9系统由单链的 guide RNA 和有核酸内切酶活性的 Cas 9 蛋白构成，利用一段小 RNA 来识别并剪切 DNA 以降解外来核酸分子。

而近几年，Cas12也逐渐走入人们的视野，并得到了许多赞扬——那么，它与Cas9有什么不同？Cas12是一种单一的RNA引导的内切酶，这意味着它处理自己的引导RNA，因此只需要crRNA进行靶向，这使得它的整体体积比Cas9小。与Cas9产生平末端相比，Cas12a产生交错末端可能更有利于以精确方向整合DNA序列等应用。CRISPR-Cas12a基因编辑系统可作为Cas9系统的极大补充，甚至在某些编辑领域中比Cas9系统更具优势。

前文提到的β-地中海贫血（TDT）的治疗，就是来自美国达纳法伯癌症研究所、波士顿儿童医院和马萨诸塞大学医学院等研究机构的研究人员通过将CRISPR-Cas12a基因编辑应用于患者自己的造血干细胞中，开发出一种治疗最为常见的遗传性血液疾病β-地中海贫血的策略。研究发现这些经过基因编辑的造血干细胞产生得到基因校正的红细胞，能够产生功能性的血红蛋白。

Editas的研发团队也对AsCas12a进行优化，在多种具有临床应用价值的细胞如造血干/祖细胞（HSPCs）、iPSCs、T细胞以及NK细胞中，获得较高的基因编辑特异性。这种升级版的AsCas12a核酸酶可以大大加速临床级细胞的基因组改造和在治疗中的应用。