2023-07-24 11:35:48, 基泰生物 上海基泰生物科技有限公司
寡核苷酸小科普
寡核酸药物是由20-60个核苷酸单元组成的单链或双链结构,通过作用于mRNA来调控疾病基因转录翻译,抑制基因表达,主要有反义寡核苷酸(ASOs),小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。目前寡核酸药物大多通过固相亚磷酰胺化学法进行合成。化学合成按照3''-5''的方向进行。
常用的固相载体为可控微孔玻璃珠(CPG),CPG通过linker与初始核苷酸核糖的3''-OH共价结合,而核糖的2''-OH用诸如叔丁基二甲基硅基(TBDMS)的保护试剂进行保护,5''-OH则用双甲氧基三苯甲基(DMT)保护。此外,由于腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶存在伯氨基团,也需要用酰基试剂(例如苯甲酰基)进行保护。
固相合成每个循环主要包括四个步骤:去保护、偶联、氧化和加帽。合成中产生的杂质(包括最后的脱保护)有以下几种类型:
截短的序列(shortmersequences)N-X,如N-1,N-2;
更长的序列(longmersequences)N+X,如N+G,N+A;
硫代磷酸酯键(PS)产生的非对映异构体和氧化产生PO杂质;
胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶脱氨基引起的杂质;
其他杂质,如碱基脱嘌呤杂质、2''-5''连接异构杂质、序列异构体等;
目前寡核苷酸质量分析方法主要有HPLC、LC-MS、ELISA、RT-qPCR、CGE等,下图展示了文献中对单链、双链和偶联后的寡核苷酸活性药物成分(API)的检测项目和分析方法。
单链
双链
偶联
Waters UPLC 液相色谱
Waters SQD2 LC-MS
Agilent 7890B GC
WATERS XEVO TQD LC-MS/MS
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