小鼠脑组织蛋白的快速 MALDI 成像

2023-07-12 20:48:56, 质谱成像先锋队布鲁克（北京）科技有限公司-质谱仪器

MALDI-TOF/TOF质谱因其独特的灵活和方便，被用于动物组织中的完整蛋白或蛋白原位酶切的组织成像。完整蛋白成像提供了各种蛋白异变体的信息，蛋白原位酶解成像利用TOF高分辨率和准确度以及MS/MS信息确认酶切肽。

前言

近年来，以MALDI-TOF/TOF质谱为核心的MALDI质谱成像（MSI）在临床研究应用日趋广泛，该系统为组织成像应用提供了独特的多种功能。MALDI-TOF质谱仪具有质量范围宽，能够对从小分子药物到大分子完整蛋白质的各种类型分子进行成像实验。MALDI-TOF质谱对特征蛋白的组织成像，被证明具有高度区分组织亚型的能力，例如不同发展阶段的肿瘤组织^[1]。

MALDI-MSI的蛋白成像可以多种方法进行。对完整蛋白的分析揭示了各种蛋白异变体的空间分布，他们可以是与某个生物途径有关的特定修饰。例如，组蛋白特征位点甲基化和乙酰化水平可作为“组蛋白密码”。过去的研究展示MALDI-TOF成像可以很好地解析动物脑组织中组蛋白空间分布^[2]。蛋白组织原位酶切后的Bottom-up蛋白成像是完整蛋白成像的补充，因为它可以检测更大的蛋白质，它们用完整蛋白成像难以检测。此外，酶切肽在MALDI-TOF反射模式下的高分辨率测量，可以得到更好的质量准确度，其MS/MS提供了肽成像的分子鉴定信息。本应用展现了使用Top-down和Bottom-up工作流程对小鼠脑组织中的蛋白质进行MALDI成像的能力。

实验样本由慕尼黑路德维希·马克西米利安大学生物医学中心提供。新鲜冷冻小鼠脑组织的矢状切片。切片置于布鲁克导电载玻片上，对于完整蛋白成像，玻片上预涂有聚赖氨酸。完整蛋白成像的样本成像前需用Carnoy方法清洗载玻片上的组织切片，然后用芥子酸（SA）基质进行喷雾。Bottom-up蛋白成像用胰酶进行蛋白的组织原位酶切，然后通过HTX基质喷雾仪施加HCCA基质。

布鲁克rapifleX TOF/TOF质谱仪用于所有MALDI成像数据采集，获得分子量在2000- 24000的完整蛋白质谱图和分子量在600-2400蛋白原位酶切MS/MS谱图。空间分辨率为30μm。SCiLS™ Lab软件用于成像数据的图像处理和统计分析。

结果和讨论

图1和图2显示了小鼠大脑完整蛋白成像的结果。数据分析的第一步，使用无监督多元统计分析进行空间分割^[3]。图1所示的分割图反映了小鼠大脑中各个解剖区域像小脑、皮层和其他区域的分子相似性。图1还显示了小鼠大脑各区域在TIC归一化后的特异蛋白质谱。通过有监督单变量统计，即受试者操作特征（ROC），进一步研究了空间分割产生的小鼠大脑皮层和小脑两个不同的聚类，以确定可以明显区别皮层或小脑的某些蛋白。图2顶部的曲线下面积（AUC）与m/z的关系图揭示了与m/z特征匹配的各种组蛋白，表明在皮层和小脑这些蛋白的表达水平存在显著差异。图2中把小脑或皮层两个区域的TIC归一化平均光谱重叠，看到ROC分析检测到的组蛋白空间分布差异进一步显现。小脑平均光谱表明，与皮层平均光谱相比，相应组蛋白的丰度显著增加。另外，MS信号的精细结构解析反映了组蛋白组织特异性的修饰谱信息，代表了Top-down成像方法的独特结果。在四个组蛋白区域中的每个区域，都选择了一个代表性m/z，并生成各自的离子图像（图2下）。这些图像再次证实了ROC结果，并说明这些蛋白质物种在小脑区域明显的共定位。这里的Top-down蛋白成像结果与Lahiri等人^[2]早些时候报告的用布鲁克ultrafleX III仪器获得的数据完全一致。而rapifleX MALDI-TOF/TOF以几乎两倍ultrafleX III的像素分辨率进行成像, 采集速度提高约14倍。

图1. 小鼠大脑矢状切面完整蛋白MALDI成像。空间分割2个不同区域的光学图像（左上）；分割图（左中）；分割树（左下）。空间分割总测量区域（右上）、小脑（右中）和皮层（右下）的平均光谱。

图2:完整蛋白MALDI成像的ROC分析，分割图中小脑和皮层区域的比较。ROC图, 灰色m/z范围是组蛋白区域（上），小脑（棕色）和皮层（蓝色）组蛋白放大区域的叠加平均光谱,（中）, 各种组蛋白的离子图像（下）。

图3-5总结了新鲜冷冻小鼠脑切片胰酶酶切后的肽成像结果。肽谱图相似性分析给出了空间分割，显示了小鼠大脑的解剖结构（图3）。特别是分割图中红色的聚类清楚地代表小脑区域。选择MS成像中检测到的不同的肽，进行组织原位MS/MS分析，然后用MASCOT搜库得到的肽序列如图3所示。

图3：小鼠脑矢状切片获得的胰酶切蛋白成像的空间分割。和分割提取小脑区域重叠的光学图像（左上）,分割图（左中）,分割树（左下）. 总测量区域（右上）和小脑的平均光谱（右下）. 列表显示了组织原位MS/MS鉴定的肽。

图4：胰酶切肽m/z 931.5+/-0.2Da的离子图像, 丰度最高的区域原位MS/MS用于鉴定组蛋白3.3的酶切肽序列ARTKQTAR。

其中一个被鉴定的肽是源自组蛋白3.3（Mus musculus）的ARTKQTAR m/z 931.54，图4 是它的MS离子图像，以及从最高丰度区域组织的肽原位MS/MS光谱。组蛋白3.3酶切肽在小脑区域的定位与之前描述的完整蛋白成像中观察到的H3组蛋白的空间分布高度一致。为了进一步证明这些结果，采集了酶切肽m/z 931.54的MS/MS图像，其最丰富肽碎片（[b+18]7，m/z 775.4）的空间分布如图5所示。所得的MS/MS图像再次显示了组蛋白3.3酶切肽在小脑区域的明显定位，这与完整蛋白以及上述肽MS成像结果完全一致。

图5：组蛋白3.3胰酶切肽ARTKQTAR m/z 931.5的MS/MS图像，MS/MS谱图中生成MS/MS图像的最丰富的碎片离子[b+18]7(红色箭头)。

结论

布鲁克rapifleX MALDI-TOF/TOF质谱作为一个独特的多功能分析平台，能够对不同阶段的蛋白质进行MALDI组织成像, 包括Top-down完整蛋白成像和胰酶切肽MS成像，以及组织原位MS/MS肽鉴定和酶切肽MS/MS成像。这些工作流程可以提供相互补充的信息。虽然Top-down的方法在检测单个蛋白变异体的能力是独特的，但酶切肽的MS和MS/MS成像增加了额外的特异性维度，并允许通过MS/MS分辨重叠的同重肽分子。本实验对小鼠脑组织中组蛋白和其他蛋白质的空间分布，显示了rapifleX多种 MALDI成像方法的能力。结合HTX基质喷雾仪和SCiLS™ Lab分析软件，rapifleX可作为高空间分辨快速MALDI组织成像系统的首选。

参考文献

S. Rauser, C. Marquardt, B. Balluff, S.-O. Deininger, C. Albers, E. Belau, R. Hartmer, D. Sukau, K. Specht, M.P. Ebert, M. Schmitt, M. Aubele, H. Höfler, A. Walch, J. Proteome Res., 2010, 9 (4), 1854–1863
S. Lahiri, N. Sun, V. Solis-Mezarino, A. Fedisch, J. Ninkovic, A. Feuchtinger, M. Götz, A. Walch, A. Imhof, Proteomics, 2016, 16, 437-447
T. Alexandrov, M. Becker, S.-O. Deininger, G. Ernst, L. Wehder, M. Grasmair, F. von Eggeling, H. Thiele, P. Maass, J. Proteome Res., 2010, 9 (12), 6535–6546