原核转录组知识大放送！一文带你走进原核转录组的世界

同为研究微生物产品的原核转录组，不同于扩增子与宏基因组产品。16S/18S/ITS 统称为扩增子产品，是对特定目标区域进行扩增后再进行测序分析。宏基因组(Metagenome)也称元基因组，是对微生物整个基因片段进行测序的研究方法。要覆盖微生物整个基因片段，所以宏基因组比扩增子需要的数据量更多，有更完整的基因序列因此也可以进行基因功能注释分析。然而，原核转录组是一种单菌落微生物转录本测序，能够获得转录本的结构信息及表达信息，基于NGS平台，通过除核糖体RNA、构建链特异性文库，从基因序列水平和表达水平获得原核生物在某个时期或者在某种环境条件下转录出来的所有转录本（包括mRNA，非编码RNA等）的表达量差异信息及功能特征，找到关键的差异功能基因，揭示微生物不同表型形成的分子调控机制。

原核转录组结构特征：原核生物是多顺反子 mRNA，具有5''、3'' UTR，不具有 poly（A）尾巴，转录与翻译同时进行，寿命期短，具有可变操纵子结构。

对于基因组尚未测序和注释的生物体，转录组需要利用测序数据重新组装。基于参考的转录组组装和从头转录组组装都存在许多成熟的计算工具。然而，大多数工具主要是为真核转录组设计的，细菌基因组通常比真核基因组更密集，并且相邻的细菌转录本经常重叠，这使得区分相邻细菌转录本的边界具有难度。多顺反子信息使细菌转录组组装进一步复杂化，特别是当在不同条件下使用操纵子的不同启动子时。此外，真核生物中非编码RNA的模型通常不适用于细菌中常见的小调节RNA。

Rockhopper 2^[1] 软件结合两个数据结构，de Bruij 图和 Burrows-Wheeler 指数，使用类似于 RPKM 的测量来估计转录本丰度水平，该测量将转录本的读段数相加，除以转录本的长度和归一化因子。Rockhopper 2 使用更强大的上四分位数转录本表达归一化，使用了高质量的转录组组装，并且在细菌数据组装上优于其他领先的组装软件如：Trinity、SOAPdenovo2。

原核无参转录组分析主要包括数据产出统计、转录本组装、基因表达水平分析、差异表达基因分析、GSEA等内容。除转录本组装外，与原核有参转录组分析结果基本重叠。

*如果没有合适参考基因组，也可以搭配做三代测序的细菌小基因组组装，获得相对更精确、完整的基因组信息和注释用于原核转录组分析。

原核转录组实验流程

原核转录组分析流程（有参）

Rockhopper2参考基因组比对分析原理

Rockhopper 2 从头转录组序列组装原理

PCA图

差异基因火山图

GO富集条形图

KEGG富集气泡图

4.3 GSEA

基因集富集分析 (Gene Set Enrichment Analysis, GSEA) ^[3]是一种用于确定一组预先定义的基因是否在两种生物状态（例如表型）之间显示出统计上显著的或一致的差异的计算方法。其分为三个步骤,分别为计算富集分数、估计富集分数显著性水平和矫正多重假设验证。GSEA 分析是基于全部检出基因进行分析，同时对基因集进行了过滤，默认的标准是基因集最小基因数量为 15、基因集最大基因数量为 500。

 GSEA 示例图

基因分组聚类示例图

5.1、基因组装与结构预测

用 Rockhopper 2 软件将测序结果得到基于序列比对数据获得基因图谱，将该图谱与参考基因注释进行比较，鉴定边界和新基因。

统计文件包括预测非反义转录本数目、预测转录本数目、预测多基因操纵子数目、预测反义 RNAs 数目、差异表达的蛋白编码基因数目、5'' 端 UTR 数目、3'' 端 UTR 数目。

根据鉴定转录起始位点和转录终止位点以及注释文件中的翻译起始位点和翻译终止位点预测得到 UTR 位置信息及其长度信息:

3'' 端UTR长度统计图

5'' 端UTR长度统计图

5.2、操纵子预测

原核生物功能上相关的几个基因往往串联在排列在一起，构成操纵子结构作为一个表达单位，用Rockhopper 2 软件将操纵子预测算法从纯序列特征发展到结合测序实验数据（即计算所得基因表达量），即联合基因间距离和基因表达量相关性两个特征用朴素贝叶斯分类器模型来预测操纵子。对预测得到操纵子进行长度分布、包含的结构基因数目和操纵子链分布进行计算和可视化。

操纵子长度分布图

操纵子结构基因数目统计图

操纵子链分布图

5.3、反义基因预测

新预测的基因中如果基因与已知编码基因重叠或包含，且位于不同的链上，则该基因判定为反义基因，使用 Rockhopper 2 软件预测，反义基因分为三种类型：全部包含（enclosed），3'' 端重叠（convergent）和5'' 端重叠（divergent）。在测序数据来源于链特异文库的条件下，可以预测反义基因位置、类型和数量。

反义基因统计图

5.4、非依赖 Rho 因子的终止子预测

原核生物基因组中有转录终止信号，称为终止子，部分基因转录终止需要辅助蛋白 Rho 因子，但其它基因核心酶本身即可终止转录。不依赖于 Rho 因子的转录终止子具有两个重要结构特征：DNA 顺序有双重对称(dyad)，位于 RNA 3'' 端之前 15-20 核苷酸处和 DNA 模板链中有一串约 6 个 A，转录为 RNA  3'' 端的U。双重对称的意义在于其基因能形成发夹结构。采用 TransTermHP^[4] 软件预测不依赖于 Rho 因子的终止子序列。

转录终止子示意图

5.5、sRNA 序列预测

原核生物 sRNA 是一类长度在 50-500 bp 的小 RNA 分子，用 Rockhopper 2 软件预测 Novel 基因，RNAFold 分析其茎环结构，进行二级结构预测，使用 IntaRNA[5] 进行靶基因预测，可综合判断 Novel 基因是否为潜在的 sRNA。

5.6、SD 序列预测

SD（Shine-Dalgarno）序列仅存在于原核生物中，SD 序列是一个存在于信使 RNA 上的核糖体结合位点，通常位于起始密码子上游。除引导翻译过程外 SD 序列还有调控翻译效率的作用。采用 RBSfinder[6] 软件预测包含 SD 序列。

SD 序列示意图

5.7、SNP 分析

SNP（Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性），是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。以组装好的转录本为模板序列，将原始序列与其进行比对，利用 samtools 软件进行染色体坐标排序、去重等处理，再用 samtools、bedtools 等软件预测样本中的 SNP 和 INDEL 位点。然后利用 snpEff 等软件进行功能注释。为了降低 SNP&INDEL 检测的错误率，使用 QUAL (A quality score associated with the inference of the given allele) 大于等于 20，且 DP（combined depth across samples）大于等于 4 进行过滤结果。对 SNP/INDEl 在基因组上各功能区域的分布进行统计。

参考文献

[1].De novo assembly of bacterial transcriptomes from RNA-seq data. Brian Tjaden. Genome Biology, 16:1, 2015

[2].Love M I , Huber W , Anders S . Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2[J]. Genome Biology, 2014. 

[3].Aravind Subramanian, Pablo Tamayo, Vamsi K. Mootha. Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles[J]. PNAS, 2005

[4].C. Kingsford, K. Ayanbule and S.L. Salzberg. Rapid, accurate, computational discovery of Rho-independent transcription terminators illuminates their relationship to DNA uptake[J]. Genome Biology, 2007

[5].Martin Mann, Patrick R. Wright, and Rolf Backofen. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions[J]. Nucleic Acids Research, 2017

[6].Chang TH, Huang HY, Hsu JB, Weng SL, Horng JT, Huang HD. An enhanced computational platform for investigating the roles of regulatory RNA and for identifying functional RNA motifs[J]. BMC Bioinformatics, 2013

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排版人：七七

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