项目文章Cell Reports （IF 8.8）| 中国农业大学利用转录组+代谢组揭示玉米矮花叶病花叶症状显现规律的分子机制

健康(模拟接种)和SCMV感染的玉米叶片组织

为精确确定花叶症状的发作过程，在接种当天的8小时光照后用绿色荧光蛋白(GFP)标记的SCMV (SCMV-GFP)接种每个玉米幼苗(两片叶期)的第一片真叶，近89.37%的接种植株在第5天出现了花叶症状。为确认花叶症状的诱导需要光照，从第5天的第4h开始，将光照期改为暗生长期，尽管植物的SCMV-GFP荧光强度的增加与正常光周期下生长的受感染植物相似，但在60 h后植物仍未出现花叶症状，表明SCMV诱导的玉米花叶症状是光依赖性的。叶片在第5 天4-8 h出现花叶症状后，过氧化氢(H₂O₂)水平才显著升高，且在荧光显微镜下观察到H₂O₂积累于线粒体，而非叶绿体，说明SCMV感染的花叶症状与玉米组织中的mROS积累有关。

为研究SCMV感染玉米植株中控制光依赖性诱导花叶症状的分子途径，取症状前期（第5天的0.5、2、4h）和症状期（第5天6、8h）的玉米叶片组织进行RNA测序。数据显示，大多数DEGs水平在pre-SS和SS时均上调。pre-SS和SS有141个共同的DEGs，GO分析表明这141个DEGs主要参与代谢过程，KEGG分析显示糖酵解/糖异生是主要的代谢改变过程。糖酵解相关的基因GAPDH-3、GAPDH4、 MDH2、TPI5、PDC-2、PDC3和PDH3在症状发展过程中表达水平上调，C₄光合作用途径（包括二羧酸和卡尔文循环）的基因水平下调，三羧酸循环相关基因CS1、ACO3、FUM1、SCS2和MDH3在线粒体中显著上调，MCP、AOX-2和AOX3 表达也上调（图2）。以上结果表明，在花叶症状的发展过程中，呼吸通路被激活，这有助于线粒体中ROS的积累。

为研究呼吸通路相关代谢物在花叶症状的表现中的作用，靶向检测SCMV感染玉米花叶病发病过程中（第5天2、4、6h）能量代谢相关代谢物的变化情况。结果显示，大多数代谢物，如葡萄糖-6-磷酸、果糖-1,6-二磷酸、甘油三磷酸、PEP、OAA、苹果酸、琥珀酸、NAD⁺、NADH、AMP、ADP和ATP含量在2-4 h显著升高，其中仅苹果酸、NADH 和 AMP在 6 h（SS）降低。对苹果酸进行多时间点靶向检测，发现苹果酸含量在症状前期显著增加，而在症状期无明显变化。进一步对苹果酸循环通路相关基因进行qRT-PCR检测，发现MCP、NDT1、MDH3和AOX3的表达水平在症状前期和症状期均显著上调（图3）。以上结果表明，SCMV感染在花叶症状发作期间激活了呼吸通路和苹果酸循环。

上述结果表明苹果酸累积和氧化与花叶病的表现有关。因此，研究者进一步检测了苹果酸含量对花叶病症状的影响。用苹果酸处理，玉米叶片在3天后显示出花叶症状表型，并且叶绿体受损，线粒体中H₂O₂积累，苹果酸循环通路相关基因MCP、NDT1、MDH3和AOX3的表达水平显著上调（图4）。中断苹果酸循环通路，ZmGAPDH3 / 4-，ZmMCP-和ZmMDH3-沉默的玉米植株花叶症状减轻，mROS水平显著降低，MDH3的表达水平显著下调，MDH的氧化活性显著降低。外源添加线粒体电子传递链抑制剂鱼藤酮可减轻SCMV-GFP诱导的玉米花叶症状（图5）。以上结果表明，苹果酸循环产生的mROS在SCMV感染组织花叶症状的发展中起至关重要的作用。

为验证SCMV感染后在光照下通过光合作用增加苹果酸盐，研究者检测了光合活性、PPDK丰度、PPDK酶活性和T527的磷酸化水平（PPDK酶活性可通过Thr527,31,48的可逆磷酸化进行昼夜光/暗调节），发现在2-4 h，光系统(PS)-II的最大光化学效率(Fv/Fm)显著增加，PPDK的酶活性显著升高；磷酸化水平在0-8 h下降；PPDK丰度在感染前期保持不变，在感染期下降；ppdk-2突变体植株花叶症状减弱，mROS水平降低（图6）。以上结果表明，SCMV感染刺激PPDK的酶活性，进而增强感染前期和感染期玉米叶片组织中苹果酸的生物合成。