案例分享 | 华东理工药学院借助MST技术检测结膜黑色素瘤靶点

2023-05-30 16:46:34, NanoTemper 诺坦普科技（北京）有限公司

华东理工大学药学院

葫芦素B诱导GRP78-FOXM1-KIF20A通路介导的

结膜黑色素瘤细胞G2-M细胞周期停滞

前言

结膜黑色素瘤 (Conjunctival Melanoma，CM) 是一种罕见且致命的黑色素细胞恶性肿瘤，位于眼表。它约占所有眼部肿瘤的2%和所有非皮肤黑色素瘤的1.6%。CM在人群中发病率低，发病机制极其复杂，潜伏期长，因此更难治愈。大多数CM源于原发性获得性黑变病 (Primary acquired melanosis，PAM) 或结膜色素痣。但迄今为止，关于CM的遗传和表观遗传特征还没有更深入的阐明。

2022年10月，华东理工大学药学院李剑教授与上海九院眼科徐晓芳/贾仁兵教授团队合作在Acta Pharm Sin B（IF=14.903）上发表了题为“Cucurbitacin B-induced G2-M cell cycle arrest of conjunctival melanoma cells mediated by GRP78–FOXM1–KIF20A pathway”的研究论文，揭示了葫芦素B能够抑制结膜黑色素瘤直接靶点及其作用机制。

https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.05.021

葫芦素B

葫芦素B (CuB)是最丰富和最常研究的葫芦素衍生物之一，它是从葫芦科植物中分离出来的四环化合物。作为一种传统药物，CuB具有多种药理活性，如抗炎、解热、抗糖尿病和抗癌活性，这些活性由不同的调节信号通路介导。在中国，CuB已被用作慢性肝炎和原发性肝癌的辅助治疗药物。在此研究中，作者通过细胞学实验第一次发现CuB能够显著抑制具有典型NRAS和BRAF突变（包括CRMM2、CM-AS16、CRMM1 和 CM2005.1）的CM细胞的增殖，而对正常细胞无毒性。

亲和力检测

为了确定CuB的直接作用靶点，作者采用ABPP（Activity-Based Protein Profiling）的化学蛋白质组学策略，筛选到GRP78蛋白鉴定为潜在靶标。GRP78已被验证为多种癌症的潜在生物标志物和治疗靶点，可抑制癌细胞的进展、增殖、侵袭和转移。接下来作者需要通过直接的实验证据证明筛选得到的GRP78蛋白为CuB的直接靶点。

作者首先通过热位移（TSA）结合测定证明，与对照相比，使用CuB处理过的样品(0.2 mmol/L) 以温度依赖性方式增加细胞裂解物中GRP78的热稳定性（图1），表明GRP78和CuB之间可能存在直接相互作用。

图1注：CuB与 GRP78 过表达 293 T 细胞的细胞热转移结合测定。

之后，评估CuB与GRP78的亲和力，团队使用了NanoTemper的Monolith NT. Automated分子互作仪进行MST检测，结果显示CuB与GRP78的亲和力为0.11 μmol/L（图2，红色曲线），与细胞活性一致。MS/MS分析表明，在经过CuB处理的重组GRP78样品中，GRP78的Lys326位点存在α-β--不饱和酮修饰。作者检测CuB与突变体 GRP78 (Lys326Ala) 的亲和力明显减弱，其Kd值为 25.40 μmol/L（图2，蓝色曲线）。综合其他实验，证明了CuB通过α-β-不饱和酮部分与GRP78相互作用。