2023-05-19 15:42:42 伯乐生命医学产品(上海)有限公司(bio-rad)
在神经元细胞分化过程中,🔗常用的管家蛋白(如β-actin、β-tubulin、GAPDH)表达量通常会发生变化;🔗在小鼠的不同脑组织部位,这些管家蛋白的表达也常常不一致。所以,在使用这些样品作为Western实验材料时,需要特别小心,以免因其表达量的不稳定导致误导性的Western blot定量结果。
发表在《Nature》期刊中的“Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism”一文,为准确使用Western定量磷酸化eIF4E及磷酸化MNK1在脑组织中的表达,采用了Stain-Free总蛋白作为内参,而避免使用管家蛋白GAPDH。在论文中,作者使用小鼠脑组织及皮层神经元匀浆作为Western样品。
Western blot实验用来确定敲除NIgn3基因后小鼠脑组织中,磷酸化eIF4E及磷酸化MNK1水平的变化。研究者发现GAPDH的表达差异很大(红框),不适合作为内参使用;而Stain-Free总蛋白(绿框)显示出了极佳的表达一致性,从而被研究者选择为内参定量标准。
从Western的定量结果来看,敲除NIgn3基因后,MNK1磷酸化水平没有发生明显变化。而且总MNK1的表达与野生型相比也没有明显变化。
从实验Western结果来看,在此实验条件下,小鼠脑组织及皮层神经元中GAPDH的变化非常大。GAPDH的表达量变化不仅发生在野生型和基因敲除小鼠之间,甚至在同样的基因敲除小鼠之间,GAPDH的表达量也是有非常大的差异的。如果没有Stain-Free作为参考,贸然以GAPDH作为loading control,实验者必然会根据GAPDH条带的差异重新调整上样量,必然得出不正确的Western定量结果。
很显然,在这个western实验中,Stain-Free体现出非常明显的表达恒定优势,提供了准确的western定量结果。而以GAPDH为内参则容易导致错误的定量结论。
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参考文献:Rescue of oxytocin response and social behaviour in a mouse model of autism. Nature, 2020
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