应用分享 | 人血浆中的完整人胰岛素和五种类似物同步定量分析

质谱分析

对每种类似物的几种多电荷母离子进行观察，通常选择其中最丰富的两种进行CID，在方法开发过程中对一或两种特征碎片离子进行监测。一些情况下，会有比最终选择的强度更高的MRM通道存在。具体来说，大多数胰岛素都会产生强度很高的亚胺离子碎片。例如，甘精胰岛素会在m/z 136产生酪氨酸亚胺离子碎片。然而，对萃取血浆进行的试验表明，使用较高的m/z母离子和碎片离子（表1）显著提高了在基质中的特异性，这比灵敏度的明显差异更为重要（图3）。相对之前报告过的纳米级色谱分析-亲和纯化方案，这种情况更适合用分析级LC-传统SPE方法。然而，人胰岛素和赖脯胰岛素只有B链中氨基酸28和29的位置互换（图1），这导致它们的碎片离子谱图几乎完全重叠。这两种物质的区别只有一个低分子量碎片，人胰岛素的碎片为m/z 226，而赖脯胰岛素的碎片为m/z 217（图2B），这两个碎片都来自于B链中的最后两个氨基酸。由于无法基线分离，MS定量必须依赖于这些非特异性碎片，因此选择性的样品制备和高效色谱分析十分关键。

图2. 谷赖胰岛素、门冬胰岛素、地特胰岛素和甘精胰岛素的MS/MS谱图。

图3. 两种不同通道的甘精胰岛素提取离子色谱图。使用亚胺离子碎片（上图）与使用较高m/z的母离子和碎片对（下图）相比缺乏特异性。

液相色谱分析

较大的肽段和小蛋白（胰岛素即是）与小分子不同，在多孔颗粒中的传质性能较差。因此，使用填充实心核颗粒的色谱柱可以在较高流速下产生生物分析研究需要的更尖锐的峰形。尤其对胰岛素来说，CORTECS C18+色谱柱结合实心核颗粒技术和表面少量正电荷，在此类应用下可以获得新水平的分离性能，获得的胰岛素峰宽度通常为4.0到4.5秒，峰面积增大了2倍。

使用多维色谱有助于通过柱上稀释（ACD）技术提高进样体积，同时利用捕集和反向洗脱策略进一步净化样品。结合使用这些色谱系统组件，可以提高进样体积至40 μL而不发生胰岛素流穿。在1D系统上，当进样体积>10 μL时就会发生明显的色谱流穿现象（此处不作数据说明）。

图4. 人胰岛素、五种胰岛素类似物和牛胰岛素(内标)的UPLC-MS/MS色谱图。

线性、准确度和精度

用以下最终浓度的胰岛素混合物对人血浆进行增浓：50、100、200、500、1000、2000、5000和10000 pg/mL。在人血浆中制备以下浓度的质量控制（QC）样品：150、750、2500和7500 pg/mL。

使用牛胰岛素(最终浓度10 ng/mL)作为所有胰岛素的内标（IS）。对分析物峰面积与IS峰之间的峰面积比（PAR）进行计算。校准曲线在人血浆中制备，使用校准样品的PAR，应用单一浓度加权线性回归模型进行构建。然后根据各自的校准曲线，通过PAR值计算所有QC样品的浓度。所有曲线均为线性，采用1/x回归。

通过x轴截距计算确定合并控制或单独控制的血浆中人胰岛素的基底浓度。然后，将所有标曲和QC样品的加标浓度加上人胰岛素的基底浓度（平均值为1937 pg/mL），以实现准确定量。

表2. 所有胰岛素的标准曲线性能汇总。

图5.赖脯胰岛素的典型标准曲线。

对所有QC样品的日间/日内准确度和精密度进行了计算。表3、4和5列出了甘精胰岛素、赖脯胰岛素和人胰岛素的典型汇总统计。所有其它类似物都表现出相似的数据。

表3.甘精胰岛素QC样品的日间/日内准确度和精密度。

表4.赖脯胰岛素QC样品的日间/日内准确度和精密度。

表5.人胰岛素QC样品的日间/日内准确度和精密度。

特异性

对所有类似物在六种人血浆源中的基质效应与其变异系数进行了计算，2007 AAPS白皮书中对此进行了概述。地特胰岛素、甘精胰岛素、门冬胰岛素、谷赖胰岛素和赖脯胰岛素的基质效应变异系数分别为12.3、11.6、11.8、9.0和7.7，全部符合建议标准，即变异系数小于15%。这项试验中，血浆样品配制为所有类似物的最终浓度5 ng/mL。此外，将这些样品的子集用200倍浓度的人胰岛素加标至人胰岛素的最终浓度为1 μg/mL，再对所有样品进行预处理、萃取和定量。人胰岛素浓度较高时，所有类似物的峰面积都没有发生明显变化。