实验新人必读-蛋白定量上手攻略

在蛋白质的提取、纯化和分析过程中，蛋白质的定量随处可见。比如在裂解细胞之后，应对各个样品中的蛋白进行定量，确保下游实验的数据平行度；在电泳之前进行定量，保证上样量一致，这样目的条带含量的变化才有说服力。

BCA法是最经典的蛋白定量方法之一，在Google学术搜索中已有14万条结果。与Bradford或Lowry等方法相比，BCA法对去垢剂的兼容性更强，也有着高度的均一性，不同蛋白质之间的变异性更小。BCA法还具有更高的线性度，它的线性范围是20至2000 µg/mL。即使是低至5 µg/mL的样品，通过改良操作也能够灵敏检测。

蛋白定量虽然是常规操作，由于涉及多个步骤的计算与处理，操作时还是容易出错。我们基于经典BCA法归纳了实操指南，以及高频问题解答，快来看看吧。

标准品和工作液的制备

A. 梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品

按照表 1 制备一组蛋白质标准品。将一安瓿的牛血清白蛋白标准品（BSA）稀释到几个干净的小瓶中，建议使用与待测样本相同的稀释液。

表 1. 梯度稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品

B. 制备 BCA 工作液

1.计算所需的工作液总体积。公式：(标准品的个数 +待测蛋白质样本的个数) X ( 实验重复次数) X (用于每个样本的工作液的体积)

注：在微孔板方案中，每个样本需要 200μl 工作液。

2.将 50 份 BCA 试剂 A 与 1 份 BCA 试剂 B 混合（试剂 A 与试剂 B 的比例=50:1），制备工作液。

注：当试剂 B 加入试剂 A 中时，开始会观察到浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作液。工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数天。示例: 如总共需要7.2mL BCA工作液，则混合7.1mL试剂A与142μL试剂B。

如何开展微孔板方案？

蛋白定量常见问题

Q

哪些物质会干扰BCA定量分析的结果？

A: 部分干扰 BCA 定量分析的物质包括还原性物质、螯合剂以及强酸或强碱，即使浓度很低也可能会影响定量的结果：维生素 C EGTA 铁离子低纯度蔗糖儿茶酚胺低纯度甘油脂类色氨酸肌酐过氧化氢蜜二糖酪氨酸半胱氨酸酰肼酚红尿酸另外。一些物质对 BCA 定量分析方法的干扰程度较低，当其在原始样本中含量低于某特定浓度时，仅对结果造成微小影响（可耐受）。此外，多种干扰物质可能产生加和作用，例如当样本缓冲液中含有多种干扰物质时，即使其中单一干扰物质的浓度低于可兼容浓度，总体仍有可能对蛋白质的定量分析产生干扰。

Q

BCA法与Bradford法应如何选择？

A.主要由样本中的干扰物质决定。如果你的蛋白抽提试剂中含有大量去垢剂且不含有螯合剂、还原剂时，可使用BCA法；如果你的蛋白里含有EDTA等金属螯合剂或者含有还原型物质，且不含有去垢剂时，可使用Bradford法。

Q

蛋白抽提完是否可以直接蛋白定量？

A.依据测试过的数据，Thermo Scientific M-PER，RIPA总蛋白抽提试剂，Mem-PER Plus膜蛋白抽提试剂，NE-PER核蛋白抽提试剂，亚细胞组分分离试剂盒等均可直接使用BCA进行蛋白定量，T-PER抽提后的蛋白经过稀释可使用BCA进行定量。

Q

BCA法能检测多肽浓度吗？

A.不能，检测多肽浓度需要用专门的多肽浓度检测试剂盒，如Pierce™ Quantitative Fluorometric PeptideAssay（货号23290），或Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay（货号23275）

Q

BCA法需要孵育至少30分钟，有没有更快的方法？

A.全新Pierce 快速Gold BCA试剂盒（货号A53225，A53226），只需孵育5分钟，室温下即可进行。此外，Gold BCA试剂盒保留了经典BCA法的高线性、高去垢剂兼容性和低蛋白差异性，使用更加快捷、简便。

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