癌症代谢通路之抗体验证

研究中，代谢重编程是癌细胞的一个指标[1]。即使在有氧的条件下，癌细胞仍然倾向于将葡萄糖代谢成丙酮酸盐、继而有氧糖酵解乳酸(又被称为Warburg effect)，而不是相比之下更有效率的氧化磷酸化途径[2]。这个发现有助于将代谢紊乱与癌症联系起来[3]。

癌症相关代谢特征分为：(1)不受调控的葡萄糖和氨基酸摄入，(2)投机取巧地获取营养，(3)利用糖酵解或三羧酸(TCA)循环的合成中间体，用于生物合成和产生NADPH，(4)氮需求增加，(5)代谢物驱动的基因调节的改变，(6)与微环境有代谢互作。这些代谢的特性中，葡萄糖和谷氨酰胺代谢被广泛研究，其中一些关键蛋白正在被研究是否适用于干预治疗[4,5]。

Altman, B., Stine, Z. & Dang, C. . Nat Rev Cancer 16, 619–634 (2016)

那么，我们有哪些可用于癌症代谢通路研究，且经过高级验证的Invitrogen抗体呢？

糖代谢抗体

研究已发现，缺氧能够通过激活HIF1-α、GLUT1、HK2、PKM2、PDK、ENO1或LDHA，来增强乳酸的产生和肿瘤的生长。在大多数癌细胞中，PKM2上调，会导致代谢途径重新定向乳酸的产生[6]。

Invitrogen™抗体使用siRNA介导的敲低来减少靶标表达，从而保证了这些抗体的特异性。图1显示了在存在siRNA介导的基因敲除的情况下，使用多种细胞系对Invitrogen™抗LDHA和抗PKM2抗体在Western Blot上的特异性。

图1. LDHA和PKM2抗体特异性的确认

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(A) LDHA的蛋白质印迹分析是使用各种细胞系的膜富集提取物进行的。用Invitrogen™LDHA抗体ABfinity™兔寡克隆 (2.5 µg / mL, 货号711782）探测印迹，并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL)检测，1:4,000稀释，货号A27036)。观察到对应于LDHA的35kDa条带 (B)使用siRNA介导的LDHA敲低通过蛋白质印迹分析确定该LDHA抗体的特异性；光密度测定法分析显示，在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下，LDHA表达降低 (C)使用各种细胞系的膜富集提取物进行PKM2的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™PKM2多克隆抗体（1:1,000稀释, 货号PA5-23034）探测印迹，并使用山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP（0.25 µg / mL, 1:4,000）检测稀释）。观察到对应于PKM2的58kDa条带 (D) 使用siRNA介导的PKM2敲低通过蛋白质印迹分析确定该PKM2抗体的特异性；光密度测定法分析显示，在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下，PKM2表达降低。化学发光检测是使用Invitrogen™iBright™FL1000成像系统及Invitrogen™Novex™ECL化学发光底物试剂盒(货号WP2000) 进行的.

葡萄糖代谢的表观遗传控制

糖代谢的表观遗传调控，主要通过NAD +依赖的去乙酰化酶家族(SIRT1-7)来进行，特别是SIRT6通过诱导GLUT1、PFK1、ALDOC、PDK1和LDHA的表达，上调葡萄糖代谢。线粒体去乙酰化酶SIRT3起到抑癌作用， SIRT3失活会导致线粒体代谢紊乱 [7] 。图2A和2B显示了使用各种细胞系并在存在siRNA介导的SIRT3敲除的情况下，Invitrogen™抗SIRT3抗体对蛋白质印迹的特异性。

图2. SIRT3和TIGAR抗体特异性的确认

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(A)使用各种细胞系的富含膜的提取物进行SIRT3的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™SIRT3多克隆抗体(1:1,000稀释,货号PA5-28402)探测印迹，并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL，1 :4,000稀释,货号A27036)。观察到对应于SIRT3的29kDa条带(B)通过使用siRNA介导的SIRT3敲低的蛋白印迹分析确定SIRT3抗体的特异性；密度测定法分析显示，在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下，SIRT3表达降低 (C)使用各种细胞系的全细胞提取物进行TIGAR的WB分析。用Invitrogen™ TIGAR多克隆抗体(1:5,000稀释，货号PA5-29151)进行分析，并使用山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL,1:4,000稀释) 。观察到对应于TIGAR的30 kDa条带，在经阿霉素处理的MCF7细胞中TIGAR表达增加。按照图1所述使用iBright成像系统。

致癌基因和葡萄糖代谢

致癌基因和抑癌基因与癌细胞中葡萄糖代谢的调节有关[8]。TIGAR蛋白（TP53诱导型糖酵解和细胞凋亡调控蛋白）的表达受野生型抑癌基因p53影响上调，导致果糖2，6-二磷酸生成受到抑制，葡萄糖代谢重新导向磷酸戊糖途径[9]。如上图2C显示了使用Western blot，验证了Invitrogen™抗TIGAR抗体在使用和未使用阿霉素处理的MCF7细胞中的特异性。

研究谷氨酰胺代谢的抗体

谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，可为TCA循环和脂质生物合成提供碳元素，在许多癌细胞中均观察到谷氨酰胺水平升高的现象。谷氨酰胺酶（GLS）辅助的谷氨酰胺水解会产生包括谷氨酸盐在内的多种代谢产物，随后，谷氨酸脱氢酶（GLUD）将其转化为α-酮戊二酸。致癌基因（例如c-Myc和K-ras），可以激活GLS1和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT），而K-ras能够抑制增殖细胞中的GLUD1，因此这些谷氨酰胺代谢酶已成为潜在的癌症治疗靶点[10]。

图3显示了分别使用免疫荧光和Western blot，验证由siRNA介导的靶基因敲低得到的Invitrogen™抗GLS和抗GLUD抗体的特异性测试。

图3. 谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酸脱氢酶(GLUD)抗体特异性的确认

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（A）在HepG2细胞中使用siRNA介导的免疫荧光/免疫细胞化学(IF / ICC)方法证实了Invitrogen™GLS抗体(克隆6H5L15)，ABfinity™兔单克隆抗体(5 µg /mL,货号701965)的特异性。; siRNA处理的HepG2细胞显示线粒体GLS表达降低。用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L) Superclonal™二抗检测Alexa Fluor™488(绿色,货号A27034)，使用ProLong™Diamond Antifade Mountant染色细胞核，以检测抗GLS抗体。用DAPI(蓝色,货号P36962)和细胞骨架F-肌动蛋白用Invitrogen™罗丹明鬼笔环肽(货号R415)标记。(B) 使用各种细胞系的富集膜的提取物进行GLUD的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™GLUD多克隆抗体(1:2,000稀释，货号PA5-29492) 探测印迹，并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP（0.25 µg / mL,1:4,000稀释度；货号A27036）。观察到对应于GLUD的55kDa条带（C）使用siRNA介导的GLUD敲低通过蛋白质印迹分析确定该GLUD抗体的特异性

本文提到验证过的Invitrogen™抗体信息如下

除上述用于葡萄糖代谢的抗体外，Thermo Fisher Scientific还提供了广泛的针对各种TCA循环中间体以及脂质和脂肪酸代谢的经过应用测试的特异性抗体。

相关文献

1.Hanahan D, Weinberg RA (2011) Cell 144:646–674. 

2.Warburg O,Wind F,Negelein E(1927)J GenPhysiol 8:519–530.

3.Pavlova NN,Thompson CB(2016)Cell Metab23:27–47. 

4.Vander Heiden MG,DeBerardinis RJ (2017) Cell 168:657-669

5.Martinez-Outschoorn UE, Peiris-Pagés M, Pestell RG et al. (2017) Nat Rev Clin Oncol 14:11–31.

6.Kato Y, Maeda T, Suzuki A et al. (2018) Jpn Dent Sci Rev 54:8–21.

7.Hirschey MD, Shimazu T, Goetzman E et al. (2010) Nature 464:121–125.

8.Kroemer  G,  Pouyssegur  J  (2008)  Cancer  Cell 13:472–482.

9.Bensaad K, Tsuruta A, Selak MA et al. (2006) Cell 126:107–120.

10.Robinson MM, McBryant SJ, Tsukamoto T et al. (2007) Biochem J 406:407–414.

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