赛默飞整体解决方案助力PROTAC 新药开发

能够使靶点从“不可成药性”变成“可成药性”！PROTAC技术作为一种全新的药物发现策略，越来越受人们的关注！

1. 不依赖“占位驱动”，超越小分子可能实现的效果

2. 用量小，催化剂量即可，毒副作用小

3. 克服靶蛋白突变/过表达引起的耐药

4. 不依赖于亲和力，可选择性高

5. 清除蛋白堆积

同时，PROTAC也面临着一些亟待解决的问题，比如：E3连接酶及其配体的拓展、E3连接酶突变带来的耐药性、Hook效应、脱靶毒性等？

赛默飞作针对PROTAC新药开发，提供从早期筛选，到体外，体内药理药效验证的完整解决方案，在一定程度上解决了PROTAC面临的问题。

“大音希声，大象无形”，赛默飞基于超高分辨质谱仪的“无通量”小分子药物筛选方案，实现超高通量的化合物库筛选，极大提高了拓展配体分子的选择性，具体思路如下：

1. 对每个化合物创建质谱图，建立包含成千上万个化合物质谱图的数据库；

2. 将所有化合物混合在一起，构建化合物pool；

3. 将带有标签（比如HIS、磁珠等）的靶蛋白，加入化合物pool中，充分孵育；

4. 将靶蛋白化合物混合液过柱纯化，比如镍柱，磁力架等；

5. 清洗掉非特异性结合的化合物后，再把结合的化合物洗脱下来；

6. 将洗脱液过质谱仪分析，对比质谱图数据库即可知与靶蛋白结合的化合物。

Q Exactive™ HF 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪

Lu, Y., Qin, S., Zhang, B., Dai, A., Cai, X., Ma, M., ... & Wang, M. W. (2019). Accelerating the Throughput of Affinity Mass Spectrometry-Based Ligand Screening toward a G Protein-Coupled Receptor. Analytical chemistry, 91(13), 8162-8169.

结论：在本研究中，我们基于高分辨质谱，实现在一个Pool中筛选分析20000个化合物，极大提高了筛选通量。应用于发现A2AR配体时，该方法能够从高复杂性的化合物池中重复鉴定出高亲和力Hits。

使用该方法，我们期望可以进一步提高通量，在一个池中分析数十万甚至上百万个化合物。

基于该筛选方案，利用不同的E3连接酶突变体，进行多轮筛选，可解决E3连接酶突变带来的PROTAC分子耐药性问题！

基于赛默飞Orbitrap系列的超高分辨质谱在蛋白组学中的应用，可轻易而举的解决小分子药物的靶点特异性分析的难题，能够最大程度减小PROTAC分子的脱靶毒性，具体方案如下：

1. 制备人源细胞裂解液，可预先敲出药靶基因，排除靶基因的干扰；

2. 将偶联有生物素的小分子药物，加入到细胞裂解液中孵育；

3. 过链霉亲和素亲和柱，清洗非特异性结合的蛋白；

4.  加入洗脱液洗脱与小分子药物结合的蛋白；

5. 将洗脱混合液，用Orbitap LC-MS做肽图分析，跟蛋白数据库对比，即可得知与药物结合的是什么蛋白。

Orbitrap Exploris™ 240质谱仪

LanthaScreen技术采用Terbium（铽/Tb）和绿色荧光素搭配（GFP、FITC、Alexa 488等），340nm激发，分别检测490nm和520nm两个发射波长，与传统TR-FRET相比，具有背景更低，灵敏度更高，Assay Window更大等优点。

赛默飞LanthaScreen Ubiquitin Biochemical Assay，提供两种设计巧妙的通用型Assay模型，通过TR-FRET信号的变化，检测靶蛋白的泛素化水平高低，从而能够评估PROTAC三元复合物的功能活性，具有高灵敏，高通量，操作简单，省时省力等特点。

Assay Window超过10倍，Z factor大于0.8，可实现靶蛋白泛素化的实时动力学检测。

Ubiquitin Biochemical Assay Format 1

Ubiquitin Biochemical Assay Format 2

实验结果：Assay window大于10倍，Z’大于0.8，可实现泛素化动力学检测

Ubiquitin Cellular Assay原理

三元复合物的形成是PROTAC降解靶蛋白的关键，但PROTAC分子浓度较高时会产生Hook效应。PROTAC可以与E3连接酶配体和靶蛋白配体分别作用形成二元复合物，导致降解活性的下降。

PROTAC的hook效应（图来自网络）

利用LanthaScreen技术，可以分别在生化和细胞水平上开发出，评估PROTAC分子HOOK效应剂量的Assay，具有无需包被，无需洗涤，操作简单，省时省力等优势，具体Assay设计模型如下：

Hook Effect LanthaScreen Biochemical Assay

Hook Effect LanthaScreen Cellular Assay

在实验数据读取方面，素有“Assay开发必备利器”的赛默飞Varioskan LUX多功能酶标仪，具有极佳的光学性能和优化的整体软硬件设计，满足生命科学实验室丰富而多样的实验需求，帮助您获得最理想的实验结果。其应用覆盖光吸收、荧光（包括FRET）、化学发光、AlphaScreen/AlphaLISA及时间分辨荧光（包括TR-FRET/hTRF）等信号检测。

Varioskan LUX多功能酶标仪

Varioskan LUX 是一款模块化的可升级仪器，具有光栅和滤光片两种波长选择方式。其创新的自动增益调节功能是VarioskanLUX领先于同类产品的重要技术特征，能够将仪器的检测能力发挥到极致。无论样品浓度高或低，VarioskanLUX都能在获得最佳检测灵敏度的同时，确保宽广的动态范围，从而保证不同浓度的数据均具有一致性和可比性。

Varioskan LUX 提供五种测量模式，包括终点检测、动力学检测、光谱检测、动力学光谱检测和多点检测，其集成式气体控制模块可为基于细胞的检测控制 CO₂ 和 O₂ 浓度，智能安全控件可在潜在问题发生之前将其识别并对用户发出提醒。基于仪器性能可靠性的考量，LUX带有自动化仪器校准和自检功能。

PROTAC分子的分子量通常比常规的小分子化合物要大很多，能否有效穿透细胞膜，直接影响PROTAC药物的作用效果，因此准确评估PROTAC分子的细胞膜渗透率，对于PROTAC新药开发意义重大。

基于赛默飞Vanquish™Duo UHPLC系统和OrbitrapExploris™ 120质谱仪，能够极为精准的从细胞裂解液中，定量分析进入细胞内的PROTAC分子。思路如下：将PROTAC分子孵育细胞后，清洗分离细胞，制备细胞裂解液，将细胞裂解用UHPLC分离，然后用Orbitrap质谱仪进行定量分析，从而能够精准定量进入细胞内的PROTAC分子，计算出PROTAC分子的细胞膜渗透率。

 Vanquish Duo UHPLC 系统     Orbitrap Exploris 120 质谱仪

在药物代谢分析方面，赛默飞基于串联质谱方法（LC-MS/MS）的解决方案，可提供卓越的选择性，具有良好的准确性、精准性和较宽的定量范围，具有分析通量高，多重分析能力强的特性，且方法开发时间短。

Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪

Thermo Scientific™ Q Exactive™ 组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪可以快速可靠地识别、定量和确认更多化合物。该LC-MS/MS系统将四极杆母离子选择性与高分辨率和准确质量数（HRAM）Orbitrap检测相结合，提供出色性能和多功能性。Q Exactive质谱仪特别适用于非目标或目标化合物筛查，也能够实现广泛的定性和定量应用，可广泛用于药物发现、代谢物鉴定、临床研究和法医毒理学。

此外在DMPK分析时的样品前处理阶段，Thermo Scientific™ Transcend™ II 系统将专有的 Thermo Scientific™ TurboFlow™ 在线样品制备技术和独有的 HPLC 多通路技术结合，提升数据质量、降低成本，并在不影响数据质量或灵敏度的情况下提高 LC/MS 通量。最大程度地减少了手动样品制备的需要，可直接将样品注入 LC-MS 系统——包括血浆、尿和其他复杂基质。

Thermo Scientific™ Transcend™Turboflow系统