STAR Protocol | 不使用病毒怎么实现近生理条件下对SARS-CoV-2的清除实验?

2023-02-08 12:18:00, 安捷伦细胞分析 安捷伦细胞分析事业部(BioTek)


STAR Protocols



抗原特异性CD8 + T细胞群对于清除细胞内病原体至关重要,特别是病毒感染的细胞。


来自德国的科学家分享了一种简便的杀伤检测方法,在近生理系统中测定 SARS-CoV-2 特异性T细胞受体改造的 CD8+ T细胞抗原呈递的功能。并详细介绍了SARS-CoV-2-ORF改造的靶细胞的应用,这种靶细胞可以确保整个靶抗原的表达以及天然肽切割和表位呈递,因此,它可以作为一种替代感染的近生理杀伤测定,而无需使用传染性病毒材料和相关生物安全基础设施。

xCELLigence RTCA eSight 简单的工作流程


Part.

1

准备:构建A549-ACE2-RFP-HLA-A*03:01 (Nsp2-GFP)细胞

1

通过慢病毒的基因修饰,将ACE2和RFP蛋白整合到A549细胞系上表达;

2

通过逆转录病毒将HLA-A*03:01整合到A549-ACE2-RFP 细胞上表达,并将该细胞命名为competent A549;

3

最后通过逆转录病毒将SARS-CoV-2-ORF 的Nsp2-GFP整合到competent A549细胞上,命名为competent A549-Nsp2细胞。

4

利用xCELLigence eSight通过阻抗和成像滴定competent A549-Nsp2细胞的接种数量(Fig 2);


Part.

2

1

Step1构建OTR-engineered SARS-CoV-2-specific CD8+ T 细胞

利用电转和CRISPR-Cas9技术将SARS-CoV-2抗原特异性的TCR基因(S13: highly functional;S32: low functional)导入CD8+ 原代T细胞,这两种TCR均受HLA-A*03:01 限制性且识别表位为SARS-CoV-2 ORF1_VTN;

2

利用xCELLigence RTCA eSight仪器进行转基因抗杀伤检测

1

 xCELLigence E-plate VIEW 96孔板中加入培养基进行背景值检测;

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将稀释好的competent A549-Nsp2细胞接种到E-plate VIEW 96孔板中,并在xCELLigence RTCA eSight中检测24h;

3

按照E:T比稀释SARS-CoV-2-specific T 细胞;

4

 在靶细胞培养24h后,将稀释好的SARS-CoV-2-specific T细胞加入到E-plate VIEW 96孔板中,并进行细胞阻抗和成像的实时连续检测(Fig.7 & 8);


Part.

3

结果分析

所有阻抗与图像的数据分析都基于xCELLigence仪器自带软件。在competent A549-Nsp2细胞的接种滴定数据来看(Fig.2),研究者选择在接种24h后阻抗数据Cell index值在1-3之间的细胞数作为后续实验中的接种数(10000 cells),同时对于明场成像结果中的细胞融合度也做了同步分析。


转基因抗原杀伤实验的阻抗数据结果表明,在加入强功能的SARS-CoV-2特异性TCR(S13)改造的T细胞后,阻抗曲线出现瞬时下降趋势,并随着ET比的增加趋势更加明显。而弱功能的TCR(S32)只出现微弱的曲线下降(其中A549与A549-Gaussia细胞都作为阴性对照细胞,medium作为T细胞的阴性对照处理)。从阻抗结果来看,xCELLigence RTCA eSight可以捕获细胞长时程实时变化的数据,基于数据检测的高灵敏度,因此可以呈现明显差异趋势变化的数据。

Fig.7 转基因抗原杀伤实验-阻抗数据

杀伤实验的成像数据分析是基于靶细胞的RFP总荧光强度变化的统计,总体趋势与阻抗数据一致,因xCELLigence RTCA esight的成像功能从另一种可视化角度辅证了阻抗数据的准确性。

Fig.8 转基因抗原杀伤实验-基于成像数据的靶细胞RFP总荧光强度分析

Part.

4

结论

这篇Protocol为大家提供了一个简便的抗原特异性T细胞的对细胞内病毒清除的检测方法,并能有效避免使用感染材料,减少操作人员的风险暴露,同时抗原转基因靶细胞也提供了近乎生理的抗原处理以及抗原表位递呈方式。当然研究人员也提出这篇Protocol不局限于SARS-CoV-2等病原体的清除检测,同样可以应用于TCR-T等肿瘤细胞疗法的研究。

Agilent xCELLigence RTCA eSight将显微成像与实时无标记检测进行整合,实现了活细胞成像与高灵敏度生物传感技术的完美结合,阻抗生物传感器与明视场和 3 个荧光通道相结合,可以满足客户同时对同一细胞群进行实时阻抗和成像检测。xCELLigence RTCA eSight将实时阻抗监测的简便性、分析灵敏度和客观性与活细胞成像的高特异性读数相结合,能够连续追踪细胞生长过程,可获得细胞行为前所未有的细节;兼容多种孔板类型,分析多达 5 个不同的参数,为科研人员提供更多丰富的信息。可广泛应用于药物研发,疫苗开发以及肿瘤免疫治疗等领域,为客户提供全新解决方案,助力研究人员尽早推出安全有效的药物和细胞治疗产品。


更详细的步骤请参考原文S-CoV-2 CD8+ T cell killing assays using replicating viruses and transgenic antigens. STAR Protocols 3, 101699, December 16, 2022



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