BIOMED PHARMACOTHER | 安捷伦细胞分析解决方案助力乳腺癌药物开发

2022-12-23 16:08:51, 安捷伦细胞分析安捷伦细胞分析事业部（BioTek）

2022 年 6 月，青岛大学附属医院医学研究中心常晓天教授团队在生物医药杂志 Biomedicine & Pharmacotherapy 上在线发表文章《Anti-PADI4 antibody suppresses breast cancer by repressing the citrullinated fibronectin in the tumor microenvironment》，利用动物模型验证了 PADI4 抗体对人乳腺癌异种移植的荷瘤小鼠有治疗作用，并通过体外细胞实验证明了 PADI4 抗体通过抑制细胞外基质成分（ECM）的瓜氨酸化（citrulli-nation）对肿瘤产生治疗作用的猜想—— PADI4 抗体可以通过改变肿瘤细胞和组织的微环境来达到治疗肿瘤的效果。

肽基精氨酸脱亚胺酶 PADI4（peptidyl arinine deiminase 4）能将多种蛋白质中的精氨酸转化为瓜氨酸，这种现象被称为瓜氨酸化，是一种翻译后修饰。PADI4 的异常表达及其翻译后修饰与多种疾病有关，包括癌症、类风湿性关节炎、心血管疾病和神经系统疾病^[1-6]。

现有研究证实，PADI4 在各种恶性肿瘤组织和患者血液中都有高表达，且其表达水平与肿瘤的病理分类、肿瘤亚型和临床表现有关，是胃癌、食道癌、结肠癌和乳腺癌的易感基因^[5,6]。以 PADI4 作为肿瘤治疗的靶点，已经开展了一些研究，并证明了一些 PADI4 小分子化合物抑制剂具有抑制肿瘤细胞生长的作用^[7]。

团队的前期研究结果也发现，乳腺肿瘤组织中 PADI4 的表达水平远高于邻近组织，患者血液中 PADI4 的浓度也显著高于健康人和术后患者^[2,3]，PADI4 作为乳腺癌易感基因，在乳腺癌发生中起重要作用^[6,8,9]。为了探究 PADI4 抗体是否对乳腺癌有治疗作用，作者首先筛选并制备了一个能够靶向识别 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞 PADI4 的鼠源抗人 PADI4 单克隆抗体，然后使用 MDA-MB-231 细胞株建立裸鼠乳腺癌模型，将制备的 PADI4 单抗注射到该动物模型中，通过 PET-CT 、组织病理学、生化检测、血常规检测、细胞因子和代谢检测评估了注射 PADI4 抗体后荷瘤小鼠的变化。

动物实验结果表明：

与未经处理的小鼠相比，经抗体处理的小鼠肿瘤的重量、体积均有减少（图 1 A、B、C 和 D），肿瘤细胞活性降低（图 1 E，F 和 G）；H&E 染色结果显示肿瘤细胞的细胞质空泡化，细胞核出现固缩甚至消失，少量肿瘤细胞凋亡和坏死（图 1 H），TUNEL 还显示，PADI4抗体处理后肿瘤组织中凋亡细胞的比例增加（图 1 I）。荷瘤小鼠外周血和肿瘤组织中瓜氨酸水平相比正常小鼠有显著升高，PADI4 抗体处理后有明显降低。肿瘤中 EMT 相关基因表达也有所降低，以上实验结果表明，PADI4 抗体对荷瘤小鼠有治疗作用。

通常，抗体不能进入肿瘤细胞内部，那么 PADI4 抗体是如何对荷瘤小鼠发挥治疗作用的呢？

作者研究发现，肿瘤组织中的多种细胞外基质（ECM）成分被瓜氨酸修饰，包括纤连蛋白、波形蛋白和 I 型胶原，而这些瓜氨酸化 ECM 成分在刺激肿瘤细胞生长和转移方面发挥着重要作用。因此，PADI4 抗体可能是通过抑制 ECM 成分的瓜氨酸化对肿瘤产生治疗作用。

因此作者设计了体外细胞试验来进行验证：选择了最重要的 ECM 蛋白之一——纤连蛋白，纤连蛋白在组织微环境中对肿瘤发生起到重要作用。

试验首先用 PADI4 蛋白使纤连蛋白瓜氨酸化，产生瓜氨酸化纤连蛋白（Cit-Fn）。然后用 Cit-Fn 培养 MDA-MB-231 细胞，再用 PADI4 抗体来处理 Cit-Fn 培养过的细胞，通过细胞增殖、凋亡、集落形成、迁移与侵袭、代谢以及瓜氨酸含量来检测培养的细胞。

体外细胞试验结果表明：

用 Cit-Fn 处理的乳腺癌细胞显示出更强的细胞增殖、迁移、集落形成能力，糖酵解产生 ATP 的比率显著增加，而细胞凋亡减少；但是经过 PADI4 抗体处理之后，乳腺癌细胞的生长和迁移减少，集落形成受到抑制，细胞凋亡增加，糖酵解产生 ATP 的比率降低，细胞的瓜氨酸化水平降低。

研究团队用详实的试验数据证明了 PADI4 抗体可能是一种潜在的肿瘤抗体药物，在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值。PADI4 抗体对细胞外 PADI4 活性的抑制可以抑制细胞外瓜氨酸化过程，从而显著改变肿瘤细胞的组织微环境，损害肿瘤细胞的生长和转移。

在这个研究中安捷伦细胞分析事业部的四台先进的细胞分析设备贯穿了始终，帮助研究团队从多个维度研究并验证了 PADI4 抗体对乳腺癌的治疗作用。

NovoCyte D2040R 流式细胞仪（临床型号）进行单克隆抗体的筛选和验证、细胞因子检测和细胞凋亡检测（图 4 D）

NovoCyte D2040R 流式细胞仪

xCELLigence RTCA DPlus 实时无标记细胞分析仪进行细胞增殖与细胞迁移分析（图 4 C）

xCELLigence RTCA DPlus 实时无标记细胞分析仪

BioTek Lionheart FX 全自动智能成像分析系统进行自动化划痕成像与数据分析（图 4 B）

另外，文中涉及的 Transwell 实验和 TUNEL 可以使用 Lionheart FX 来进行自动化成像和一键计数；石蜡切片亦可通过 Lionheart FX 进行彩色明场成像和拼接，获得高分辨率大图。

BioTek Lionheart FX 全自动智能成像分析系统

（兼容气体控制和湿度控制）

隐藏技能

用于检测瓜氨酸的 ELISA 实验，BioTek 的酶标仪和洗板机可以提供自动化帮助哦

ELISA 黄金搭档：

800TS 酶标仪 + 50TS 自动化洗板机

Seahorse XFp 分析仪进行细胞能量代谢分析（图 4 E）

Seahorse XFp 分析仪

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原文链接：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332222006783

参考文献：

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关于 BioTek

BioTek 是世界领先的多功能微孔板检测仪及软件的研发生产公司，拥有 54 年的悠久历史。BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪拥有灵活的功能配置和优异的检测结果，配合友好强大的操作软件，为广大用户提供了便捷高效的使用体验。服务科学，促进科学始终是我们追求的目标。2019 年 BioTek 加入安捷伦科技有限公司，成为细胞分析事业部的重要组成成员。

关于安捷伦

安捷伦科技有限公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，致力于为提升人类生活品质提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。2022 财年，安捷伦营业收入为 68.5 亿美元，全球员工数约为 18,000 人。