核苷酸分析和制备分离的通用阴离子交换色谱法

寡核苷酸一般是由15～50个核苷酸组成，可以在基因水平上干扰致病蛋白质的产生，从而达到治疗疾病的目的。核苷酸作为寡核苷酸的构件基本单元，通常由一个核碱基、一个糖基以及至少一个磷酸基团组成，因此，具有极性大以及负电性强烈的特点，在常规的反相色谱条件下保留较弱。根据这样的结构特征，常用的分析方法有反相离子对色谱、亲水色谱、离子交换色谱法、毛细管电泳和PCR等方法。

本文介绍了一种用于药物开发和生产中常见核苷酸分析和制备分离的通用阴离子交换色谱法，将TOSOH TSKgel SuperQ-5P W色谱柱与基于碳酸氢铵的全水相洗脱液相结合，开发了一种简单、高效、经济的IEC通用方法。使用ACD Labs LC-Simulator色谱模拟软件对方法进行了优化，实现了在单次实验运行中分离20种核苷酸，并通过使用制备型FPLC仪器成功地应用于大规模纯化复杂的核苷酸混合物，大大减少了化学家们在每次纯化前开发分析和制备色谱方法的时间和资源，直接实现了分析级到制备级的跨越，实现了直接的放大过渡，同时降低了成本成本以及对环境的影响。此外，这些构建的通用性 IEC 条件色谱方法与ACD Labs建模相结合，可以已成功应用于有效地用作方法开发过程中的起点，以高效地分离本研究中描述的列表之外的其他高极性核苷酸。

第一轮筛选在2根阴离子色谱柱：Sepax. SAX-NP10（4.6×50 mm）Sepax. WAX-10NP（4.6×50mm）上分别探索了3组洗脱液和2个梯度：

进样体积：10μL

流速为0.5 mL / min，

柱温：25℃

检测波长：254nm

第二轮筛选，在两根强阴离子交换柱上，探索了3种洗脱液：

梯度：0min（5%B），80-100min（100%B），100.1-120min（5%B）

流速：0.27mL/min

柱温：22℃

样品温度：45℃

检测波长：210、254和280nm

根据峰形、保留、分离、树脂的成本以及批量形式的可用性，基于以上色谱柱、梯度以及洗脱液的筛选结果，选择TOSOH TSKgel SuperQ-5PW （10）（4.6 × 150 mm, 10μm）作为固定相色谱柱，以以及水为洗脱液A，1M碳酸氢铵溶液（pH 8.0）为洗脱液B作为方法优化的起点，建立梯度＆柱温（2×3）模型：实验设计如下，流速0.27mL/min。

通过ACD/Labs软件LC-Simulator模拟生成分辨率图分离度图，可得到的最佳梯度和温度组合条件选择为：梯度：10%–90% B（60 min）；柱温：30℃。2D分离度图；进样体积：5μL；检测波长：254nm。见图2b：

图2.从建模（a）到实验条件（b）分离20种核苷酸的方法开发2D分离度图和最佳的分离度条件对应预测谱图

根据以上ACD/Labs软件优化得到的最佳条件，衍生得到放大纯化的IEC条件，AKTApilot在70mm×500mm（20μm）TOSOH TSKgel SuperQ-5PW（20μm）色谱谱柱上实施，最大载样量可高达250ml。根据上述的2D分离度图，找到适合分离纯化#3和#7杂质的梯度温度条件，使得上样量高达250mL。分离纯化是在TOSOH TSKgel SuperQ-5P W (70mm×500mm, 20μm) 色谱柱上进行的，所以需要根据色谱柱的规格对找的最佳参数组数进行调整。最终适合#3和#7杂质纯化的条件分别为：

#3纯化梯度&温度条件：

柱温：22℃

图3#3杂质纯化谱图

#7纯化梯度&温度条件：

柱温：22℃

本研究中值得一提的几点：

1.通过分离度图，得到了多个关键分离对（例如核苷酸2和5,3和6）的分离条件，使得20种核苷酸能够同时分离，展现了现代色谱模拟和建模软件在应用于方法开发时的强大功能。将这些模拟色谱数据与实验结果进行比较，能够完美的匹配，见表1。预测数据与实验数据之间的总体差异△TR低于0.26min。

表1：20种核苷酸的预测和实验保留时间值摘要

2.流动相全水相，成本低、环保、可通过传统干燥技术去除，这在实施大规模的纯化过程中至关重要。

3.TOSH TSKgel SuperQ 5PW，其基质是亲水性聚合物聚甲基丙烯酸，键合的官能团为三甲氨基，在本研究中被证明是分离核苷酸的优秀固定相。

4.这种通用的IEC分析条件（树脂和缓冲洗脱液）可被有效地用作方法开发的起点，用于分离和纯化核苷酸中间体和工艺相关杂质，这种方法有助于简化放大过渡过程并加快纯化的速度。当组分成倍增加时，通过对洗脱液梯度、色谱柱尺寸和流速的微调即可实现分离，显著地节省了时间。