文章解读 | 胶质母细胞瘤蛋白质组的区域图谱揭示了肿瘤内异质性的三轴模型

1.样本数量

研究队列包括 25 名患者，其中发现集 20 名患者的肿瘤样本被制成 990 个 H&E 切片，5 名用于免疫组织化学验证。每个患者的解剖生态位的选择均由两名神经病理学家分别提供的注释通过标准化方法确定。

2.样本类型

FFPE样本

3.实验设计

实验使用了与 IvyGAP 相同的选择标准对患者样本的 TME 差异进行标准化处理。为确保足够的蛋白质组学覆盖，每个解剖生态位和患者的 LCM 区域截面积为 40,000,000 µm²。每个样本进行基于质谱的蛋白质组学分析后，将蛋白质组模式与标志性组织形态学特征相结合，并突出具有特定生态位表型水平的生物标志物和靶标，对人类GBM作图。

为了探究蛋白质组学模式在 GBM 的组织形态学生态位中是否存在差异，研究人员在大量代表性病例样本中通过形态变化和组织纯度标准化方法选取了20个采样良好的FFPE IDH-野生型原发性 GBM 样本形成一个小组。研究人员用激光捕获显微镜 (LCM)切除浸润肿瘤(IT)、分子肿瘤 (CT)、坏死组织周围栅栏状细胞 (PAN)和微脉管增殖 (MVP)区域，另外靠近肿瘤前缘 (LE) 的相邻组织学正常脑组织也被分离（图1），总共分离了86个LCM样品用于 LC-MS/MS 分析，从队列样品中共量化 了4794 种蛋白质。

主成分分析（PCA）表明，样本聚类主要由解剖生态位的蛋白质组学模式而不是患者间的差异驱动（图 2a-c）。许多非显微解剖的全组织样本在 PCA 上表现出高变异性（图 2b-d）。总之，患者中具有相同组织形态学特征的肿瘤衍生样本（IT、CT、PAN）高度聚集在一起（图 2c），结果与 Ivy GAP 的转录组数据一致。其最大的相似性出现在解剖生态位而不是患者水平（图 2d）。监督的GSEA突出了在组织形态学生态位内蛋白质水平上富集了许多通路（图 2e）。

肿瘤 LE 的相邻正常神经组织富集在与神经元系统相关的基因本体项，而 IT 区域与神经元系统以及干细胞通路相关。CT 区域与分化和生长有关，而 PAN 与压力、缺氧和免疫反应有关。MVP 显示了与血管生成、免疫调节和创伤反应有关程序的富集。这些构成了GBM 蛋白质组可以区别区域性特定生态位的特征。

研究人员使用 Spearman方法与 Ivy GAP 的转录谱进行了蛋白质组学比较（图 3a），发现相似的显微解剖区域之间其最高相关性约0.4。差异蛋白质丰度（cut-off p = 0.01）突出显示 1314 种区域富集的蛋白质（图 3b ）。与 Ivy GAP 区域富集的基因比较显示，其中 494 种蛋白具有与其 mRNA 前体一致的升高表现（图 3c ）。相反， 820 个标记仅在蛋白质水平升高，而 209 个基因仅在 RNA 水平升高。

研究人员使用免疫组织化学方法和独立的患者样本验证了代表性候选蛋白的区域限制模式（图 3）。这包括确定的相对选择及强染色的A 激酶锚定蛋白 12（AKAP12），有报道表明这是一种可调节黑素瘤PAN 区域中由缺氧介导的生长和侵袭行为的支架蛋白（图 3d-f）。除了许多间充质特异性蛋白质外，研究人员也发现了 MVP 区域中免疫球蛋白 CD276的富集（图 3g-h）。这种非典型的免疫检查点蛋白已知可以抑制其它肿瘤中的T细胞应答，且重要的是，CD276 明显不存在于脑实质内的非肿瘤血管中，这表明其在GBM 微环境免疫抑制中的潜在作用（图 3i）。 

此外，研究人员还通过正交法验证了蛋白质酪氨酸磷酸酶受体 Z1 型（PTPRZ1）的存在，发现其仅在IT 区域表现出蛋白质水平的富集（图 3j），且确实在浸润细胞中显示出强染色（图 3k-1），并且最近有研究表明其可能与肿瘤侵袭性有关。

研究人员在此研究中训练并应用可以推断数据集中相关功能基因的激活水平的机器学习模型。为此，在分子特征数据库 (MSigDB) 中发现的数千个基因被提炼成与 GBM 生态位相关的子集。

本研究仅关注含最高比例的纯肿瘤细胞区域（接近 100%）CT 和 PAN，因为 MVP、IT 和 LE 等含非肿瘤细胞成分比例较高，可能会干扰分析。 CT 和 PAN 样本分层聚类（图 4a）为两个独立于样本区域注释的簇，这些簇在 CT 和 PAN 样本中缺乏显著富集。此外，属于同一患者的不同生态位的样本通常分布在不同的簇中（图 4a）。为了定义每个簇的功能特征，用 R 包“psSubpathway”分析了 64 个基因对簇结构的贡献，揭示了簇 1 样本中显著富集的 26 个特征，包括 GBM 间充质（Verhaak），细胞迁移和 KRAS 靶标特征（图 4b）。簇2 的特点包括富集的11 个不同的特征，如 GBM原神经、胚胎干细胞和 MYC 靶标特征。

特征富集模式揭示 KRAS 和 MYC 靶标特征之间为负相关（图 4c），尽管它们在 CT 和 PAN 区域之间混合在一起，但这些解剖坐标似乎在缺氧分子特征轴中确实相对分离，这也是本分析的一致蛋白基因组程序之一（图4d）。独立的 IVY Gap转录图谱（图 4e）验证了这种三轴分离，且在 CT 样本中确认高 KRAS 靶标活性与侵袭和上皮间质转化过程相关，而MYC 轴的样本富集与细胞周期进展相关（图 4f）。

由于上述癌症项目中的蛋白基因组学不一致和背景差异，研究人员使用曲线下面积（AUC，ROC）定义本研究的空间分布和基于蛋白质的簇的命名（图 4g）。重要的是，本研究的蛋白质组数据集中，MYC 和 KRAS 基因组驱动的分组产生了比 Verhaak 间充质和原神经基因组更可靠的样本分离。因此，该研究使用 KRAS 和 MYC特征来进一步表征数据。

为了进一步表征肿瘤内变异性，研究人员使用最新的 RNA-seq 数据，在一组单细胞水平的样本中评估了 GBM 的三个组的特征富集水平（图 4h ）， 即KRAS_TARGETS-high、MYC_TARGETS-high 或在任一特征中均未显示升高富集的中心组。与区域显微解剖样本相似，MYC_TARGETS-high 组呈现出 HALLMARK_MITOTIC_SPINDLE 特征的高度富集（图 4i），而 KRAS_TARGETS-high 细胞富集了与肿瘤侵袭性相关的 WU_CELL_MIGRATION（图 4j）。这些结果表明肿瘤组织内的大部分 GBM 细胞致癌基因似乎是稳定的，而某些亚群对相互排斥的侵袭性或增殖性表型表现出“致癌激活”。在单个样本水平发现，细胞可以表现出对应这些表型之一的强烈优势，或者混合有侵袭性的和增殖的 GBM 细胞（图 4h) 。这一结果在本研究队列中也得到了支持。

本研究证明了非肿瘤组织细胞的存在极大地影响对基因特征激活水平的推断。如，KRAS 靶标特征在 MVP 生态位中呈现极端的富集，这可能提高了整个组织中该特征的全面水平；而在非肿瘤区室 LE 和 MVP 中，MYC 靶标特征的富集最低，可能会抑制在浸润边缘附近的大块组织中的信号。缺氧特征在 PAN 生态位中水平最高；但在整个组织中观察到其在肿瘤生态位中的水平无显著差异，这种状况并不排除非肿瘤部分引入的偏差。

研究人员开发了一种计算策略来推断 CT-niche 特定的特征，在纯组织学样本中产生与 ssGSEA 分数等效的结果，而不容易受到批量 GBM 样本中存在的其它生态位的干扰（图 5a）。用组织形态学定义的样本数据生成具有已知生态位比例的合成计算混合体及其相关的特征富集分数，训练 RNA 表达数据的 XGBoost 回归模型（图 5b）。通过 TCGA-GBM 大量样本的 RNA 数据中的 CT 特异性推断（图 5d）和 CPTAC-GBM 研究（图 5e），研究人员证实了Ivy Gap 研究中通过ssGSEA在 RNA 样本中观察到的KRAS 靶标特征和 MYC 靶标之间的负相关性（图 5c）。结果表明，高水平的 CT 特异性 KRAS 靶标特征与 CPTAC 队列中更积极的临床表型和更短的总生存期相关（图 5f）。ssGSEA 在 TCGA-GBM 队列中的 RNA 水平也证实了这种关联（图 5g）。

最后，为了解区域差异是否可能导致治疗抵抗并影响患者层面的治疗决策，研究人员比较了 CTRPv2 数据集中 543 种药物对培养的GBM 细胞生长的影响（n = 31）。使用这些 GBM 细胞系作为区域表型的实验显示了轴特异敏感性和对多种药物的抗性（图 6a）。许多传统的抗癌药仅在富集的 MYC 细胞系中显示生物活性（如，3-CI-AHPC、CD-437），而基于 KRAS 轴激活的细胞系排序显示相反的结果，对于作用于许多经典癌症靶标的药物（例如，帕苯达唑）表现出了相对抗性。重要的是，尽管基于蛋白质的 KRAS 和 MYC 轴与 Veerhak 间充质和原神经转录亚型程序相关，但药物敏感性基本在后一种分类系统中不存在。这些差异可能对于药物设计和选择具有一定的作用，且被认为受益于界定 KRAS 和 MYC 轴的相对精细和集中的基因模块。

为测试是否可以对缺氧轴上细胞的其它药物敏感性差异进行建模，研究人员在高氧和低氧浓度（21% 和 0.2% O2）条件下培养并分析了患者来源的神经胶质瘤干细胞样 (GSC) 细胞（图. 6b)。蛋白印迹证实在培养 72 小时后缺氧标志物碳酸酐酶 IX (CAIX) 和 AKAP12 的时间依赖性激活，表明这些培养条件至少可以概括在该实验临床组织样本中定义的缺氧生态位的某些方面（图 6c）。在不同氧浓度的 GSC初始条件下，研究人员同时分析了它们对由 188 种激酶抑制剂组成的库的相对敏感性，其中 Alamar blue被 作为细胞生长的读数（图 6d ）。与计算分析中的 MYC 轴和 KRAS 轴类似，一些药物确实根据氧合水平显示出了不同的反应（图 6d）。例如，PDGFRB 抑制剂仅在常氧条件下显著损害 GSC 活力，在缺氧条件下则对GSC几乎没有影响（图 6e）。相反，其它药物在缺氧条件下表现出更高的效力。总之，这些发现表明除了富集 MYC 和 KRAS 的程序之外，微环境压力还可以驱动 GBM 区域生物学的动态变化，这可能会削弱或改变它们对治疗药物的敏感性（图 6f）。