欧米技术丨让蛋白质组感受压力：PCT 如何深度处理微量组织样本

2022-11-08 18:08:54, 高欢欢西湖欧米（杭州）生物科技有限公司

蛋白质组学研究是当前寻找各种疾病的潜在生物标志物与药物靶点研发的重要手段之一。世界上大多数临床组织样本珍贵，为了方便存储，大多数组织样本都经过福尔马林固定、石蜡包埋处理。因此，研究人员在使用尽可能少的样本来满足尽可能全面的检测的基础上，还需解决组织样本和福尔马林交联以及石蜡固定带来的影响，分析测试时常常面临很大的技术挑战。传统的样本前处理方法，多依赖人工操作，且步骤繁多，过程冗长；因此普遍存在样本需求量大、样本处理效率低、耗时长、且分析结果重现性差等缺点。那么如何快速、稳定、高效地对微量临床组织样本进行前处理，进行质谱数据采集，是临床多组学研究亟需解决的问题。

压力循环技术PCT (Pressure Cycling Technology) 的出现，为微量生物样品的制备提供了一种全新的途径。它的主要原理是在可设定的时间间隔内，对一个很小的密闭空间内的微量样本进行周期性的高低压循环处理，利用高压 (~ 45,000 psi) 和低压 (~ 14.69 psi) 的交替循环，对生物样本的物理结构（如结缔组织纤维等）进行破坏，进而诱导生物样品中基质（样品中被分析物以外的组分，如细胞膜、细胞连接等）的破碎和目标生物分子（如蛋白质、DNA、RNA、脂类和小分子）的释放和溶解，从而有效地提取生物分子。

△ 压力循环技术

（Pressure Cycling Technology）

目前，基于 PCT 的蛋白质组学样本前处理技术可在约 3 小时内实现从 0.3~1 mg 的新鲜组织样本 (FF) 或石蜡包埋组织样本 (FFPE) 中制备多肽。^[1]在最新的一篇技术开发文章中，研究人员对肝癌病人术后的肿瘤组织样本进行了PCT辅助的蛋白质组学分析。文章中，经过 PCT 制备后，样本的肽段回收率为每毫克组织平均 80~120μg 多肽。随后使用 45 min Pulse-DIA MS 分析，每个多肽样本平均鉴定到 54,469 条肽段，归属到 6565 个蛋白；4 个样本共鉴定到 7487 个蛋白。与 TMT 10-plex 标记和 DDA MS 的分析策略（相同的多肽样本定量 7511 个蛋白）得到的蛋白鉴定量具备可比性。基于 PCT 的蛋白质组学样本前处理方法具有流程稳定、耗时少、重现性好、肽段回收率高等特点，特别适用于大规模临床微量组织样本的前处理；为临床大队列的高通量样本前处理提供了高效的策略。

2020 年 3 月，蛋白质组学期刊 Journal of Proteome Research 发表了题为 Accelerated Lysis and Proteolytic Digestion of Biopsy-Level Fresh-Frozen and FFPE Tissue Samples Using Pressure Cycling Technology 的技术文章。研究人员在基于 PCT 的第一代蛋白质组前处理方法的基础上，在不增加试剂成本的情况下，保持高效蛋白质提取和酶解效率，将组织样本前处理的时间从 6 小时缩短到 3 小时，开发了基于 PCT 的第二代蛋白质组前处理技术，为临床大队列的样本前处理提供了更高效的策略。^[2] 接下来，我们对这篇文章从材料方法、研究路线以及研究结果几个方面做技术性解读。

材料及方法

1、组织样本：

0.3~1.0 mg 小鼠新鲜肝脏样本、0.5~1.0 mg 福尔马林固定石蜡包埋的小鼠肝脏样本、0.5~1.0 mg 福尔马林固定石蜡包埋的肝癌病人肝脏样本（肿瘤样本和癌旁样本）

2、仪器类型：

Barocycler® 2320EXT (Pressure BioSciences Inc.)

TripleTOF 6600 (SCIEX)

Q Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific)

3、数据分析软件：

DIA-NN 1.7.12; Proteome Discoverer 2.4

实验路线图

步骤1：基于 PCT, 优化和建立快速蛋白质组学样本前处理方法

步骤2：优化后的前处理方法定量准确性评估

步骤3：优化后的前处理方法在肝癌临床队列中的应用

研究结果

1. 建立和优化基于 PCT 的样本前处理方法

基于 PCT 的传统蛋白质组学前处理方法主要包含四个步骤：

(1). Barocycler 内 60 min 完成蛋白质变性及溶解；

(2). 混匀仪中 30 min 完成蛋白质还原及半胱氨酸烷基化；

(3). Barocycler 中 60 min 使用 Lys-C 酶切蛋白；

(4). Barocycler 中 100 min 使用 trypsin 酶切蛋白。

基于此方法，研究人员首先将步骤 1 和 2 合并，直接在 60 min 内完成蛋白变性，溶解及还原烷基化，然后将步骤 3 和 4 合并，Barocycler 中 100 min 完成 Lys-C 和 trypsin 同时酶切，随后对其条件进行优化。

△图1. (A) 基于 PCT, 传统的蛋白质组学前处理流程; (B) 基于 PCT, 优化后的蛋白质组学前处理流程

结果显示，石蜡包埋的鼠肝样本和新鲜的鼠肝样本使用优化后的方法进行前处理，使用 Q Exactive HF-X，进样量 500 ng，30 min 梯度下可以鉴定到约 13500 条肽段, 归属到 3000 个蛋白。与基于 PCT 的传统蛋白质组学样本处理方法相比，在不影响提取和酶解效率、肽段/蛋白鉴定数目，未增加试剂成本的情况下，肽段提取率约 80~120 μg/mg，肽段漏切率从 27.9% 降低至 26.5%，且组织样本到肽段所需时间从 6 小时降低到 3 小时。

2. 优化后的样本前处理方法定量准确性评估

研究人员对 10 个福尔马林固定石蜡包埋（∼ 1 × 1 × 5 mm3，石蜡穿孔， 0.5~0.7 mg）的人肝脏组织样本（5 个癌旁样本和 5 个肝癌样本）分别使用了两种前处理方法来评估优化后方法的定量一致性。结果显示，优化后的方法肽段提取效率与传统 PCT 方法的结果基本一致，两种方法下肽段提取率约为 100 μg/mg (图 2A)。首先使用高通量 15 min microflow-SWATH 方法结合 TripleTOF 6600 完成 20 个样本的质谱分析，在两种前处理方法中共同定量到 3828 种蛋白，定量一致性为 0.929（图 2B）。共同鉴定到的蛋白，使用无监督聚类的方法验证，结果表明两者表现出较高的一致性，其中肿瘤样本的分布相对离散，研究者认为出现这种情况可能归因于肿瘤样本的异质性（图 2C）。

△图 2. 基于 PCT 传统的前处理方法和基于 PCT 优化后的前处理在肝癌病人队列样本中的应用。(A) 传统的方法和优化后的方法对肝癌样本（癌旁组织和肿瘤组织）的肽段回收率。(B) 定量的 3828 个蛋白评估传统方法和优化后的方法定量一致性。(C) 基于两种方法共同鉴定到的蛋白进行无监督 PCA 聚类分析。

短梯度的 LC-MS 方法提高了质谱采集通量，但损失了蛋白鉴定深度。采用优化后的方法处理样本，研究者分别使用鉴定深度高的 PulseDIA 方法和 TMT 10-plex 标记定量进行质谱分析。首先，对 10 个样本进行批处理设计，PulseDIA 方法采集的队列，先将所有癌旁样本的肽段混合物和肿瘤样本的肽段混合物分别合并成一个癌旁肽段混合样和一个肿瘤肽段混合样，共两个样本，每个样本设置一个技术重复，如图 2D 所示。结果表明，在 45 min PulseDIA 方法下，平均每个样本鉴定到 54,469 条肽段，归属到 6565 个蛋白，4 个样本共鉴定到 7487 个蛋白。PulseDIA 方法中肿瘤样本和癌旁样本的技术重复之间的一致性分别为 0.9797 和 0.9748（图 2F）。随后，用优化后的前处理方法处理的 10 个样本，研究者使用 TMT 10-plex 方法结合液相分馏技术共鉴定到 7511 个蛋白和 8541 个蛋白质群。这 10 个样本分别使用 15 min microflow-SWATH、PulseDIA 和 TMT10 plex 三种方法进行蛋白定性定量，三种方法下鉴定到的蛋白从 5540 增加到 7511 个蛋白（图 2E）。

△图 2. 基于 PCT 的传统前处理方法和基于 PCT 的优化后的前处理方法在肝癌病人队列样本中的应用。(D) 肝癌队列样本在 PulseDIA, TMT10-plex 和 15 min microflow-SWATH 中分析流程。(E) 肝癌样本在 15 min microflow-SWATH, PulseDIA 和 TMT10-plex 分析后肽段/蛋白鉴定数目及对应的矩阵缺失值。(F) PulseDIA 分析中肿瘤样本和癌旁样本技术重复的一致性。

3. 本实验中样本前处理在肝癌临床队列中的应用

研究人员将本前处理方法应用到 25 对人肝癌队列（25 个癌旁样本和 25 个肝癌样本；∼ 1 × 1 × 5 mm³)。肝癌病人中 80% 为男性，90% 以上的病人年纪超过 55 岁，具体病人信息见图 3A。分成 5 个批处理（图 3B），每个样本称取 500~900 μg 石蜡包埋组织，样本前处理后肽段提取效率平均为 80~120 μg/mg，癌旁组织的肽段提取率略高于肿瘤组织样本（图 3C）。在高通量 15 min microflow-SWATH 的质谱方法采集下，平均每个样本鉴定到 18,453 种肽段，归属到 2822 种蛋白。然后，使用鉴定到的 2822 个蛋白对所有样本进行无监督聚类分析，癌旁样本和肿瘤样本在 PCA 图基本可分开（图 3D）。

在数据分析中，研究者使用前人报道的 Batch server 工具实现了不同批处理数据校正^[3]，对 2822 种蛋白进行了差异分析，共鉴定到 744 种上调蛋白和 234 种下调蛋白。其中上调蛋白中包含很多已知的肝癌样本潜在差异物例如：mini chromosome maintenance complex component 7 (MCM7), microtubule-associated protein RP/EB family member 1 (MAPRE1) 等（图 3E）。

△图 3.(A) 25 对肝癌病人临床信息。(B) 肝癌病人批处理设计。(C) 石蜡包埋的人肝脏组织样本肽段回收率。

小结

在这篇文章中，研究人员提出了一种更便捷的基于 PCT 的样本前处理方案，该方法在不影响消化效率、肽段/蛋白鉴定量及蛋白定量的前提下，可高效地将新鲜组织或石蜡包埋样本在 3 小时内完成样本前处理。这种新方法简化了手动样本处理步骤，减少了操作错误率，非常适用于临床大队列样本的前处理。

参考文献：

[1] Zhu, Yi, et al. "High‐throughput proteomic analysis of FFPE tissue samples facilitates tumor stratification." Molecular oncology 13.11 (2019): 2305-2328.

[2] Gao, Huanhuan, et al. "Accelerated lysis and proteolytic digestion of biopsy-level fresh-frozen and FFPE tissue samples using pressure cycling technology." Journal of Proteome Research 19.5 (2020): 1982-1990.

[3] Zhu, Tiansheng, et al. "BatchServer: a web server for batch effect evaluation, visualization, and correction." Journal of Proteome Research 20.1 (2020): 1079-1086.

本文作者：高欢欢

校对

审阅：

朱怡、倪诗蕾、钱丽琴、陈善军

关于西湖欧米

专注于生物技术攻关与辅助临床诊断与治疗的创新型生物科技公司。针对与生命健康有关的核心问题，西湖欧米致力于以技术创新为驱动力、以多模态大数据为基础，使用 AI 赋能微量临床组织的高通量蛋白质组分析等组学技术辅助精准医学和药物研发。

文章推荐