深度剖析 | NovoCyte Quanteon流式细胞仪对小鼠造血干细胞和祖细胞进行14色表型分析

2022-11-03 14:41:51, 安捷伦细胞分析安捷伦细胞分析事业部（BioTek）

临床上已成功将骨髓中分离出的造血干/祖细胞（HSPCs）用于造血干细胞移植多年，并可以利用一系列细胞表面标记物对这些细胞进行流式鉴定。因此，我们开发并优化了一个14色的流式实验方案用于深入分析CD45.1和CD45.2的小鼠骨髓造血干细胞（HSCs），5个多能祖细胞类群（MPPs），淋系定向祖细胞类群（CLP）和8个髓系定向祖细胞类群。

在该方案中，每个细胞群都通过特异性表达的细胞表面标记物来区分，并且使用DUMP通道将表达谱系标记物（CD3，CD11b，B220，Gr-1，Ter119）的细胞排除。HSCs和MPPs可以通过分析细胞表面蛋白Sca-1，c-Kit，CD150，CD48，CD34和CD135来鉴定。它们被定义为：HSCs （LSK、CD150+、CD48-、CD34-、CD135-）、MPP1 （LSK、CD150+、CD48-、CD34+、CD135-）、MPP2（LSK、CD150+、CD48+、CD135-）、MPP3 （LSK、CD150-、CD48+、CD135-）、MPP4（LSK、CD150-、CD48+、CD135+）和 MPP5（LSK、CD150-、CD48-、CD135-）。

此外，髓系定向祖细胞（髓系祖细胞，CMP；粒细胞-巨噬细胞祖细胞，GMP；巨核细胞-红细胞祖细胞，MEP；单能巨核细胞祖细胞，MkP；粒细胞-巨噬细胞祖细胞前体细胞，Pre GM；巨核细胞-红细胞祖细胞前体细胞，Pre MegE；红系细胞集落形成单位，CFU-E和Pre CFU-E）等由Sca-1和c-Kit加CD16/32，CD34，CD41，CD105和CD150的特异性表达鉴定：CMP（LK，CD34 +，CD16 / 32-）， GMP （LK， CD34+， CD16/32+），MEP（LK， CD34-， CD16/32-）， MkP（LK， CD150+， CD41+）， Pre GM（LK， CD150-CD105-CD41-CD16/32-），Pre MegE（LK, CD150+CD105-CD41-CD16/32-）， CFU-E（LK，CD150-CD105+CD41-CD16/32-）和Pre CFU-E （LK，CD150+CD105+CD41-CD16/32-）。然后在Sca-1和c-Kit低表达的细胞群中进一步分析CD135和CD127以区分CLP（LSlowKlow，CD135 + CD127 +）。

14色HSPCs方案基于安捷伦 NovoCyte Quanteon 流式细胞仪所开发，Quanteon配备 4 个激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 637 nm）和 25 个荧光检测器。对小鼠造血干细胞的深层次表型进行表征，大大提高我们对HSCs、MPPs以及成熟血细胞之间关系的理解。

手动圈门策略

首先，FSC-H / A，SSC-H / A和width参数用于排除细胞碎片和粘连细胞，然后圈出活细胞与Lineage-（Lineage marker包括CD3，Gr-1，CD11b，CD45R，Ter-119）的成熟造血细胞，在活细胞和Lineage-中分析CD45.1和CD45.2表达（图2A）。随后，在CD45.1和CD45.2细胞群中分析HSPCs各类群（图2B，2C）。LK（Lineage-、Sca-1-、c-Kit+）、LSK（Lineage-、Sca-1+、c-Kit+）和LSlowKlow（Lineage-、Sca-1low、c-Kitlow）是根据Sca-1 和 c-Kit的表达来定义的(i)。此外，在LK细胞类群中对髓系定向祖细胞进一步分析：CMP（LK，CD34 +，CD16 /32-），GMP（LK，CD34 +，CD16 / 32 +），MEP（LK，CD34-，CD16 / 32-），MkP（LK，CD150 +，CD41 +），Pre GM（LK，CD150-CD105-CD41-CD16 /32-），Pre MeE（LK，CD150 + CD105-CD41-CD16 / 32-），CFU-E（LK，CD150-CD105 + CD41-CD16 / 32-）和Pre CFU-E（LK，CD150 + CD105 + CD105 + CD41 - CD16 / 32-）(ii)。在LSK细胞群中进一步分析HSCs和MPP 1-5亚群：HSCs（LSK、CD150+、CD48-、CD34-、CD135-）、MPP1（LSK、CD150+、CD48+、CD135-）、MPP2（LSK、CD150+、CD48+）、MPP3（LSK、CD150-、CD48+、CD135-）、MPP4（LSK、CD150-、CD48+、CD135+）和MPP5（LSK、CD150-、CD48-）(iii)。最后，根据CD135和CD127的表达来区分CLP细胞（LSlowKlow，CD135+，CD127+）（iv）。

图 1. 小鼠HSPCs各类群分析的手动圈门逻辑。（A）首先去除细胞碎片、粘连细胞、死细胞和成熟造血细胞，然后分析CD45.1和CD45.2的表达。（B. C）在随后的分析中，以CD45.1和CD45.2细胞群的Sca-1和c-Kit的表达来定义LK和LSK细胞群以及LSlowKlow细胞群：（i）然后在LK细胞中分析CMP，GMP，MEP，Pre GM, Pre MegE, Pre CFU-E, CFU-E and MkP各细胞群。（ii）在LSK细胞群中进一步鉴定HSC和MPP1-5细胞群。（iii）在LSlowKlow细胞群中分析CLP细胞群。

高维分析

在排除粘连细胞后圈出每群细胞，在FlowJo软件中分别进一步分析LK和LSK细胞群，以进行可视化分析，如图3所示。将除去Lineage、live/dead、CD45.1和CD45.2以外的所有细胞表面标记物进行t-SNE分析，之后将t-SNE图谱分为CD45.1和CD45.2两类。随后，将手动圈门的细胞群应用于t-SNE图上，不同细胞群显示不同颜色，并分布在t-SNE图中不同位置。

图 2. 高维分析。在去除碎片，粘连体，死亡和成熟造血细胞后，分别在LK和LSK群上进行t-SNE分析（基于除了Lineage，live/dead，CD45.1和CD45.2之外的所有参数），以深入了解该14色方案的高维数据的复杂性。（A）t-SNE分析在LK细胞群中区分出了不同的髓系定向祖细胞群体将如图2所示的各种髓系定向祖细胞类群叠加到 t-SNE 图上（i-vi），t-SNE图显示了各种髓系定向祖细胞在总LK（i，iv），CD45.1+ LK（ii，v）和CD45.2+ LK（iii，vi）中的分布。（B）t-SNE分析将LSK细胞群中不同的MPPs以及HSCs细胞群区分开。将如图2所示的不同MPPs和HSCs细胞群叠加到t-SNE图上，t-SNE 图显示了他们在总LSK （vii）、CD45.1+ LSK （viii）和 CD45.2+ LSK （ix）的分布情况。

FMO对照

荧光减一对照（FMO）用于评估所有细胞表面标记物的区分。结果如图3所示，确认了真正的阴性界限并进一步验证了荧光的扩散不影响门控，并且所有细胞表面标记物没有发生分辨率损失。

图 3. 利用FMO对照来验证门控。通过FMO对照来确定除live/dead和Lineage之外的所有表面标记物的背景染色来验证门控，其中FMO对照是除待分析的抗体外染色其他所有抗体。显示的是完全染色的样品和相应的FMO的图。FMO 对照的圈门与图 1 一致。

结论

多色流式细胞术已成为免疫学研究的重要工具。该14色方案可用于小鼠造血干细胞和祖细胞的更深层次的表型表征，并大大提高我们对HSCs、MPPs和成熟血细胞之间关系的理解。我们的结果表明，使用安捷伦 NovoCyte Quanteon 流式细胞仪可以更好地检测低表达的抗原，为我们了解小鼠造血系统提供了更深度的分析方案。

参考文献

[1] Eich M, Trumpp A, Schmitt S. OMIP-059: Identification of mouse hematopoietic stem and progenitor cells with simultaneous detection of CD45.1/2 and controllable green fluorescent protein expression by a single staining panel. Cytometry A. 2019 Oct;95(10):1049-1052.

[2] Solomon M, DeLay M, Reynaud D. Phenotypic Analysis of the Mouse Hematopoietic Hierarchy Using Spectral Cytometry: From Stem Cell Subsets to Early Progenitor Compartment. Cytometry A. 2020 Oct;97(10):1057-1065.