2022-10-21 10:37:11 上海安谱实验科技股份有限公司
淀粉是由葡萄糖分子聚合而成的高分子碳水化合物,不仅是人类主要的能量来源,在食品、化工、生物医药等行业也有着广泛的应用。测定淀粉含量的方法分为直接测定法和间接测定法。
1
直接测定法
近红外法、旋光法等,如《GB/T 25219-2010 粮油检验 玉米淀粉含量测定 近红外法》、《GB/T 20378-2006 原淀粉 淀粉含量的测定 旋光法》等;
优点:测定过程简单、效率较高;
缺点:准确度较低、仪器要求较高。
2
间接测定法
水解-滴定法、比色法、试剂盒法等,如《GB 5009.9-2016 食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》,《AOAC 966.11》等
优点:准确度高;
缺点:所需试剂种类较多、成本高;其中,试剂盒法采用集成式试剂,较大程度简化了方法的复杂程度,近来也被广泛应用。见下:
方法原理
样品经脱脂等步骤后加入耐热α-淀粉酶,将淀粉水解为可溶性支链和无支链的麦芽糊精。淀粉葡萄糖苷酶将麦芽糊精定量水解成D-葡萄糖,然后葡萄糖氧化酶将D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸盐并释放一摩尔的H2O2,再用过氧化物酶催化H2O2,生成的醌亚胺染料含量用紫外光度计进行测定。
前处理方法(AOAC 966.11)
1、碾磨谷物、植物或食品以通过 0.5 mm筛网,备用;
2、准确称量 100mg左右样品,放入玻璃培养管(带盖)中。记录准确重量,轻敲试管使样品到管子的底部;
3、加入0.2mL乙醇溶液(80% v/v),充分浸润样品,使用涡旋混合 5 s;
4、立即向培养管中加入 3 mL 耐热 稀释后α-Amylase 溶液 [bottle 1用(MOPS缓冲液(50mM,pH7.0)加二水合氯化钙 (5 mM)溶液)稀释30倍] ;
5、拧紧盖子,涡旋管子 3 秒,然后将管子转移到微沸水浴中。每2 min上下震摇管子,约8min后,从微沸水浴中取出试管置于 50°C 的水浴中,使其平衡至50℃约 2 min;
6、从50℃水浴中拿出培养管,向其加入4mL[醋酸钠缓冲液(200 mM,pH 4.5)加二水合氯化钙 (5 mM)],再加入 0.1 mL Amyloglucosidase [bottle 2], 涡旋混摇匀后,将培养管在 50°C 下孵育 30 分钟;
7、从水浴中取出管子并让它们冷却至室温,倒转管几次确保盖子内侧的冷凝水与管内液体混合;
8、将培养管中液体借助漏斗全部转移至100mL棕色容量瓶中,并用蒸馏水多次清洗培养管一并转移至容量瓶中,并用蒸馏水定容,摇匀;
9、取定容摇匀后液体1mL至微量离心管中10000r离心5min,备用;
10、取离心好的溶液0.1mL至玻璃培养管(带盖)中,一式两份。
11、分别加入 3.0 mL 的 GOPOD 试剂并将溶液孵育在 50°C 保持 20 min,冷却后,上下摇匀,1h内于波长 510 nm 测试溶液吸光度;
同时孵育:
D-Glucose Standard(bottle 5 ,试剂盒提供):取0.1 mL D-Glucose Standard (1.0 mg/mL) + 3.0 mL GOPOD 试剂,一式四份;
试剂空白:0.1 mL 蒸馏水 + 3.0 mL GOPOD 试剂,一式两份;
12、测定时,光度计需先在试剂空白溶液下进行调零,然后再测试样品。
计算方法
淀粉含量%=△A*F*EV*D*0.9/w*100%
其中:△A为样品溶液扣除试剂空白后的吸光度值;
F 为因子,100除以(4份 D-Glucose Standard 孵育后所对应的吸光度值的平均值);
EV 为定容体积,第8步所对应的定容体积100,mL;
D 为第8步定容后,还要继续稀释的倍数(对于高淀粉含量样品而言,见注意事项6),若未继续进行稀释,则D为1;
w 为样品称样量,mg;
注意事项
试剂盒方法测定总淀粉含量与其他方法并无显著性差异,因其酶解的唯一性使结果更加准确可靠,但试剂盒的使用有以下几点注意事项:
1、试剂盒中GOPOD溶液需避光保存,4℃下3个月或-10℃下12个月。若进行冷冻保存,需分装在小规格棕色试剂瓶中,用1取1,避免反复冻融;此溶液新配置时为浅黄色,吸光度对照蒸馏水读数时应小于 0.1,用该溶液孵育后的标准溶液F值应符合85-115之间;
2、因试剂盒法的取样量较小,若样品不足以具有代表性导致的实验结果偏离,可适当增加样品取样量,每增加100mg样品量,再加入α-Amylase 溶液后相应的微沸水浴孵育时间需增加约10min;但最大样品称样量不要超过500mg,500mg样品量所对应的微沸水浴孵育时间约需50min。
3、对于难分散样品,可适当再增加0.1-0.2 mL乙醇溶液(80% v/v),以确保样品分散均匀;
4、水浴微沸即可,培养管中样品液体无需沸腾,刚放置进水浴的培养管会使水浴瞬时降温,因此孵育时间可相应延后2min左右;
总结
淀粉含量测定的方法多种多样以及各种化合物的检测方法均不一,每种方法各有缺点和实用性,在实际应用中,要根据样品来源、结果准确度要求、成本、操作的难易程度等多种因素来选择测定方法,才能便于实验开展,并提高数据准确性和可信度。
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