2022-09-20 00:19:56, 食品安全的守护者 山东美正生物科技有限公司
本应用对饲料原料样品(花生粕、豆粕、棉粕)中黄曲霉毒素B1(AFB1)、B2(AFB2)、G2(AFG2),G2(AFG2)的检测方法进行了验证,通过对比不同前处理方法对黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2检测结果的影响,确定了较佳的提取条件,采用自动化前处理仪器ASPE480免疫亲和固相萃取系统,建立了免疫亲和柱全自动净化-液相色谱串联质谱法测定饲料原料中黄曲霉毒素的测定方法。
结果表明:4种黄曲霉毒素在不同样本中的回收率在82.2%~109.8%之间,精密度RSD小于8.9%。本方法可批量自动化处理样品,提高工作效率,避免因人员操作导致的结果偏差,可用于大量粮食饲料中真菌毒素的精准测定。
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仪器及试剂
● 仪器设备:
AB SCIEX QTRAP 6500+四级杆-线性离子阱串联质谱仪;
Waters Acquity超高效液相色谱,配备柱后衍生系统及荧光检测器;
ASPE480全自动免疫亲和固相萃取系统;
氮吹仪;
离心机。
● 试剂和耗材:
色谱纯:甲醇、乙腈、甲酸。其他试剂如:氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾均为分析纯;
AFB1、AFB2、AFG1、AFG2标准溶液;
多功能净化柱;
黄曲霉毒素免疫亲和柱;
黄曲霉毒素磁性分子印迹微球。
实验条件
● 液相条件设置
色谱柱:Waters BEH C18柱(100 mm× 3.0 mm,1.7 μm);柱温:35℃;进样量 5 μL;流动相流速:0.3 mL/min,梯度淋洗。
流动相梯度条件
● 质谱条件设置
质谱采用电子喷雾离子源,正离子扫描模式。喷雾电压为5.5 Kv;毛细管温度为500℃;脱溶剂气为空气、碰撞气为高纯氮气,气量为 50,50arb。具体的参数见下表。
质谱扫描参数
● 固相萃取系统方法设置
按照如下方案,在ASPE480免疫亲和固相萃取系统上设置方法。如下图。
仪器方法-黄曲霉毒素B1
实验方案
● 实验样本:
本实验采用3种自然污染的黄曲霉毒素阳性样本,为花生粕、豆粕、棉粕样本。
● 方法考察:
不同提取溶剂对检测结果的影响
选取9个自然污染的花生粕样本、2个豆粕样本、1个棉粕样本和1个配合饲料样本,分别使用84%的乙腈水溶液和80%的甲醇水溶液对上述样品进行振荡提取。提取溶液按照1:4的比例加入PBS溶液稀释。稀释液全部过免疫亲和柱后,加水淋洗,甲醇洗脱。洗脱液氮吹近干,加1 mL50%甲醇溶液复溶,过0.22μm滤膜,上机检测。
不同提取溶剂对饼粕样品提取结果
由上表结果可知,对于花生粕、棉粕等饲料样品中的黄曲霉毒素,84%的乙腈水溶液作为提取溶剂的检测结果要显著高于80%的甲醇水溶液的检测结果,这表明对于饼粕类饲料样品,84%乙腈溶液的提取效率要显著高于80%甲醇。而对于配合饲料样品,两种溶剂的提取效果并不显著。
不同净化方法对检测结果的影响
选取9个自然污染花生粕样本、2个豆粕样本和1个棉粕样品,考察不同净化方法对检测结果的影响。实验选择85%的乙腈作为提取溶剂,以黄曲霉毒素免疫亲和柱、真菌毒素多功能净化柱、磁性分子印迹微球等三种净化材料对提取溶液进行净化处理,测定结果见下表:
不同净化方法对检测结果的影响
免疫亲和柱净化法的LC-MS/MS谱图
磁性分子印迹净化法的LC-MS/MS谱图
多功能净化柱法的LC-MS/MS谱图
使用三种不同的净化方法处理样品,其检测结果基本一致,并无显著差别。然而通过质谱图对比可知,使用免疫亲和柱净化法,所得谱图干扰最少,净化效果最佳。
方法验证
以花生粕、豆粕及棉籽粕样品为基础进行空白添加实验,验证该方法的准确度和精密度。每种饲料原料样品中添加3个浓度水平的黄曲霉素素,每个浓度设6个平行,计算回收率和变异系数。结果表明:在3个浓度添加水平下,平均回收率82.2%~109.8%之间,RSD值在1.9%-8.9%,方法的准确度和精密度均满足要求。
不同饲料原料中添加4种黄曲霉毒素的回收率及精密度(n=6)
实验结论
采用美正ASPE480免疫亲和固相萃取系统,建立了免疫亲和柱全自动净化-液相色谱串联质谱法测定花生粕、豆粕和棉粕中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的方法。
结果标明:黄曲霉毒素B1在不同样本中的回收率82.2%~109.8%之间,RSD小于8.9%,回收率和重现性良好。本方法可批量自动化处理样品,节省操作时间,提高工作效率,避免因人员操作导致的结果偏差,可用于大量粮食饲料中真菌毒素的精准测定。
更多产品信息
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