临界点干燥方法用于制备MicroCT分析的生物样本

2022-08-21 18:46:39, 徕卡显微系统徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

X射线微计算机断层扫描（micro-CT）是一种应用于内部解剖和生物体形态研究中的常规无创性技术。在样本旋转过程中，micro-CT扫描可从多个特定角度获得一系列投影并生成一组灰度图。几年来，随着实验室级micro-CT成像系统的数量不断增长，越来越多的研究人员开始使用该技术。

类似于其它成像技术（如扫描电子显微镜），micro-CT几乎可在任何条件下研究生物样本（例如新鲜、干燥环境或防腐剂中）。Micro-CT是对骨骼、牙齿和壳体进行3D研究的理想技术，但应用于软组织分析时，会极大地受制于低吸收对比度，这主要是由于组织样品中存在低原子序数组成的化合物。为克服这一局限性，我们可以应用多种方法，如各种染色和/或干燥技术，以及相位对比强反差图像。尽管如此，在条件允许的情况下，应尽量使用干燥的样本进行分析，因为相比在液体中扫描的样本，干燥样本的信噪比明显更高。干燥精细生物样本时，相比化学或空气干燥等方法，临界点干燥更加高效，因为它可以有效降低组织收缩和变形的程度，保留样本的原本结构。

伪蝎肌肉组织微计算机断层扫描案例

简介

样本：伪蝎（拟蝎属）

使用临界点干燥方法处理伪蝎，随后通过X射线微计算机断层扫描（micro-CT）检测解剖特性，尤其是肌肉组织。

步骤

样本架：将样本移至多孔样品篮，盖上滤盘，插入支架，放到样品仓内。

固定和脱水

乙醇（70%）：隔夜

乙醇（80%、90%、96%、100%）：2 × 10 分钟

碘染色（100%乙醇中1%碘溶液）：隔夜

乙醇（100%）：2 × 10 分钟

CPD300全自动程序

固定和扫描

将干燥后的样本粘在昆虫针上，使用Xradia MicroXCT-200 X射线成像系统（Carl Zeiss X-ray Microscopy, Inc.美国普莱森顿）对样品进行扫描。

图1：伪蝎前体三维重建图像（通过外视图和内视图可视化肌肉组织）。该数据由德国格赖夫斯瓦尔德大学的Elisabeth Lipke和Peter Michalik博士提供。

昆虫脑部微计算机断层扫描方案

简介

样本：丽蝇（叉叶绿蝇）

使用临界点干燥方法处理丽蝇样品，随后通过X射线微计算机断层扫描（micro-CT）检测神经解剖学特性。

步骤

样本架：将样本单独放在节肢动物样品篮中。

固定和脱水

Bouin固定液：隔夜

0.1 M 磷酸盐缓冲液（1.8%的蔗糖，pH 7.2）：3 × 10 分钟

乙醇（60%、70%、80%、 90%、96%、100%）：2 × 10 分钟

碘染色（100%乙醇中1%碘溶液）：隔夜

乙醇（100%）：2 × 10 分钟

CPD300全自动程序

固定和扫描

将干燥后的样本粘在昆虫针上，使用Xradia MicroXCT-200 X射线成像系统（Carl Zeiss X-ray Microscopy, Inc.美国普莱森顿）扫描样品。

图2：丽蝇头部和脑部的三维重建和虚拟截面图像。该数据由德国格赖夫斯瓦尔德大学的Elisabeth Lipke和Peter Michalik博士提供。

昆虫幼虫的微计算机断层扫描方案

简介

样本：红血虫（蚋幼虫）

使用临界点干燥方法处理红血虫样品，随后通过X射线微计算机断层扫描（micro-CT）重建内部解剖结构。

步骤

样本架：将样本单独放在节肢动物样品篮中。

固定和脱水

2.5%Glutardialdehyde（0.1M的磷酸盐缓冲液）：隔夜

0.1 M 磷酸盐缓冲液（1.8%的蔗糖，pH 7.2）：3 × 10 分钟

乙醇（60%、70%、80%、 90%、96%、100%）：2 × 10 分钟

碘染色（100%乙醇中1%碘溶液）：隔夜

乙醇（100%）：2 × 10 分钟

CPD300全自动程序

固定和扫描

将干燥后的样本粘在昆虫针上，使用Xradia MicroXCT-200 X射线成像系统（Carl Zeiss X-ray Microscopy, Inc.美国普莱森顿）扫描样品。

图3：多种器官系统的红血虫的三维重建和虚拟截面图像。该数据由德国格赖夫斯瓦尔德大学的Elisabeth Lipke和Peter Michalik博士提供。

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