2b-RAD的十大技术应用总结（上篇）

2b-RAD，革新的划时代简化基因组技术，以其高可重复性、全库测序、测序深度均一、标签独立性好等各项优势，不仅技术方法刊登在《Nature Methods》上，也广泛受到研究工作者的好评，近年来陆续发表多篇文献在各大期刊上。

欧易生物作为发明方独家授权合作的专业技术服务商，给大家总结下2b-RAD的十大技术应用。今天将带来『遗传图谱-QTL定位、性别鉴定、群体遗传研究』的分享。 

应用1：遗传图谱-QTL定位

研究背景：受全球气候变暖的影响，珊瑚表现出对高温的适应能力。人们一直认为对高温的生理适应而不是遗传适应，在珊瑚响应气候变化方面发挥主导作用。

研究内容：本研究采用2b-RAD技术构建珊瑚的遗传图谱，并对耐热基因进行了定位。证明珊瑚的耐热性是可以遗传的，而且这种适应是来源于珊瑚群体长期的遗传变异。

图1取样地点及其温度变化统计    图2耐热基因定位结果

研究策略

实验材料：将维度相差5°（图1）的较温暖海水（夏洛特公主湾，Princess Charlotte Bay, PCB）和较寒冷海水（俄尔普斯岛，Orpheus Island，OI）的珊瑚互交，共建立了10个杂交系。取样点见图1。

RNA-seq：SE50，子代测序数据量1.4-7.1M，产生0.24-1.17M（平均0.50M）uniquetranscript counts (UTCs)；亲本测序数据量1.9-11.6M，产生0.28-1.52M（平均0.67M）UTCs。

2b-RAD：F1家系349个个体。两个亲本和两个成熟珊瑚样品（共12个样品）平均reads数量为3,759,904 SE（3M），子代平均reads数量为413,525 SE（0.4M）。用JoinMap4.1构建遗传图谱。

研究结果

来自较温暖位置的珊瑚繁殖的后代拥有更高的耐热性。相较于雄性珊瑚，雌性珊瑚能更有效地将耐热性传给下一代。

高耐热性与氧化、细胞外、转运基因表达和线粒体功能的遗传差异有关，表明高耐热性是在缺乏原有胁迫的情况下出现的。

通过2b-RAD技术构建了珊瑚的遗传图谱，共有14个连锁群（LGs），包括1448个标记，总长1358cM。

定位到2个受耐热性强选择的基因组区域（图2），直接证实耐热性的自然变异是可遗传、可进化的。

参考文献

Dixon G B, Davies S W, Aglyamova G A, et al. Genomic determinants of coralheat tolerance across latitudes[J]. Science,2015, 348(6242): 1460-1462.  (IF：33.611)

应用2：性别鉴定

研究背景：中华绒螯蟹是我国重要的水产品种之一，分类地位上属于甲壳纲十足目。传统依赖于细胞生物学的研究认为十足目动物（如虾、蟹）性别决定系统为XY-XX型，但近些年也有文章对这一结论提出质疑。

研究内容：中国科学院海洋研究所崔朝霞研究员课题组，采用欧易生物提供的2b-RAD技术进行了高密度遗传图谱的构建，在此基础上进行QTL定位和GWAS分析表明中华绒鳌蟹性别决定机制为ZW-ZZ型，LG60推测为W染色体。

图1鉴定出的性别连锁群

图2性别相关位点的QTL定位及GWAS分析

研究策略

实验材料：F1家系120个个体。

文库构建：按照2b-RAD文库构建流程，对亲本采用标准5’-NNN-3’接头进行文库构建；对子代个体采用选择性接头5’-NNG-3’和5’-NNC-3’进行文库构建。

测序策略：亲本标签数41万，平均深度59X；子代平均标签数24万，平均深度25-42X。

数据分析：利用Joinmap4.0进行遗传图谱构建；利用MapQTL5.0进行QTL分析；利用GWAF进行GWAS分析。

研究结果

雌性图谱共包含5,655个标记，标记平均间隔0.77cM；雄性图谱共包含5,606个标记，标记平均间隔0.79cM。整合图谱上共包含10,358个标记，标记平均间隔0.49cM，覆盖度约为98.5%，重组率为~3.09cM/Mb（图1为性别连锁图谱）。

QTL分析将性别相关QTL定位到LG60上15.15cM区间（图2），这一区间包含69个标记。

GWAS分析在LG60上定位到46个与性别相关的标记（图2），并且这些标记全部在母本中分离，符合ZW-ZZ型性别决定的模式。

利用转录组数据对标记进行注释，其中基因ankyrin-2位于LG60上，它在发育早期各个时期都有表达，但在Z1、J3F、J3M期表达量显著上升。推测这一基因可能在中华绒鳌蟹的性别决定机制中起作用。

参考文献

Cui Z, Hui M, Liu Y, et al. High-density linkage mapping aided by transcriptomicsdocuments ZW sex determination system in the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[J]. Heredity, 2015, 115(3): 206-215.   (IF: 3.805)

应用3：群体遗传研究

研究背景：在没有物理障碍的情况下，从中小尺度空间上研究浮游生物的群体遗传结构仍然具有挑战性和争议性。浮游生物群体大和高频基因流的特点使得区分浮游生物地理分化非常困难，尤其是分子markers很少和假定平衡的情况下。二代测序技术可以同时获得成百上千的分子markers，而且新的分析方法能够直接研究非平衡群体和直接迁移。

研究内容：本研究以北大西洋的桡足类浮游生物——胸刺水蚤（Centropagestypicus）为研究对象，采用2b-RAD技术研究胸刺水蚤在北大西洋的群体遗传结构，以及胸刺水蚤沿着西北大西洋大陆架，即从大西洋中部海湾到缅因湾的群体连通性。结果表明，2b-RAD技术能够辨别浮游生物细微的群体遗传结构差异，分析动态和复杂情况下浮游生物的直接迁移和迁移模式。

研究策略

实验材料：从北大西洋收集胸刺水蚤样品，取样地点（图1）包括位于西北大西洋（NW）的大西洋中部海湾（Mid-Atlantic Bight，MAB）、新英格兰架南部（Southern New EnglandShelf，SNE）、乔治沙洲（Georges Bank，GB）和缅因湾（Gulf of Maine，GoM）；东北大西洋（NE）的北海（North Sea，NS）和比斯开湾（Bay of Biscay，BB）。共计61个胸刺水蚤样品。

图1 采样地点

文库构建和测序：采用两步法PCR、BsaXIIIB型内切酶、选择性接头5’-NNG-3’构建2b-RAD文库。测序平台选用IonProton。

RAD分型：由于胸刺水蚤基因组大小未知，用STACKS软件对27 bp的RAD tags进行de novo 组装，构建参考基因组。将每个个体的基因型与构建的参考基因组进行比较分型。

群体遗传分析：在群体遗传分析之前，用BAYESCAN和 ARLEQUIN两种不同方法分析受选择的markers。去掉正向选择的位点，保留认为是中性的、平衡选择的位点，然后用STRUCTURE软件分析胸刺水蚤的群体遗传结构。                                 

西北大西洋大陆架的群体连通性：通过MIGRATE-N软件估算群体间基因流流向，基因流流向评估共有6种模型（图2），即：① panmixia；② full migration；③ north to south；④ south to north；⑤ adjacent；⑥ Gulf Stream。

图2 基因流模型

研究结果

RAD tag 分型：61个个体共获得88.4M tags，每个个体平均reads数是787 614 （SD = 735 763; range234 798–4 746 599）。675个位点满足每个等位基因覆盖度>5X、至少在80%的个体中存在的标准，并用于后续群体分析。

群体遗传分析：两两群体比对结果表明，西北大西洋和东北大西洋不同群体之间具有显著性差异，而西北大西洋不同地区的群体之间没有明显的遗传分化，同样的情况发生在东北大西洋。群体遗传结构分析表明，西北大西洋和东北大西洋明显划分为3个clusters（K=3）（图3）。它们之间不是完全分离的，一些个体拥有混合起源。两个主效基因池对大西洋每一边群体的贡献率不同，这使得可以量化海洋盆地的个体交换。

图3 群体遗传结构分析

大西洋西北部架的群体连通性：在6种模型中，full 迁移模型的支持率最高。MIGRATE-N软件得到的迁移速率结果表明，从MAB到SNE，也就是向北的洋流强于向南的洋流，但是一般来说向南的洋流更强大。SNE、GB和GoM之间具有明显的平衡。MIGRATE-N计算得到的迁移率应该谨慎看待，因为这些数据违反了方法中的关键假设。

参考文献

Blanco-BercialL, Bucklin A. New view of population genetics of zooplankton: RADseq analysisreveals population structure of the North Atlantic planktonic copepodCentropages typicus. Molecular ecology,2016, 10.1111/mec.13581. (IF: 6.5)