项目文章 | PNAS：宁波大学陈剑平/孙宗涛团队揭示植物 RNA 病毒致病和传播的新机制

2021 年 3 月 16 日，宁波大学陈剑平院士、孙宗涛研究员为共同通讯作者，在 PNAS 杂志（IF: 9.412）在线发表了题为“A class of independently evolved transcriptional repressors in plant RNA viruses facilitates viral infection and vector feeding”的研究论文，深入报道了在不同植物 RNA 病毒中一种广泛存在的、通过劫持茉莉酸信号途径以协同促进病毒传播和介体昆虫摄食的新机制。

宁波大学博士研究生李路路、张合红助理研究员为共同第一作者，文章中酵母文库实验由欧易生物完成。

研究背景

植物病毒基因组通常仅编码少数几个蛋白，它们必需依赖寄主植物才能完成自身的侵染和增殖。因此植物病毒往往通过其编码的蛋白来劫持或者利用寄主因子来实现自身的复制，并在植物体内传播，产生系统性感染。

在宿主植物与病毒的长期共同进化中，植物为了抵抗病毒侵染而进化出了多种防御策略，植物激素及其信号转导网络占据着重要的地位。茉莉酸 (Jasmonic acid, JA) 作为一种重要的植物防卫激素已被广泛研究，并且在植物抵抗真菌和细菌的免疫应答中起到非常关键的作用，关于其介导抗病毒免疫反应的复杂分子调控机制尚未完全解析。特别是在农业生态系统中，近 80% 的植物病毒由媒介昆虫传播，如此多种多样的植物病毒能够成功侵染寄主，它们的致病机理是否存在着一定的保守性，目前了解有限。

研究内容

本研究报道了一类在不同植物 RNA 病毒中独立进化的毒力因子，它们具有转录抑制活性。Fijivirus、Tenuivirus 和 Cytorhabdovirus 都有转录抑制因子，它们在植物中与茉莉酸 (JA) 信号传导的关键成分 OsMED25、OsJAZ 和转录因子 OsMYC 相互作用。这些转录抑制因子可以直接干扰 OsMED25-OsMYC 复合物，抑制 OsMYC 的转录激活，然后与 OsJAZ 蛋白结合，以有利于病毒感染的方式协同抑制 JA 途径。同时，这些转录抑制因子通过抑制 JA 信号有效地增强了病毒介体昆虫的摄食。本研究揭示了在不同植物 RNA 病毒中的一种通用策略：病毒转录抑制因子劫持并抑制 JA 途径，以利于病毒致病性和介体传播。

研究结果

1.植物 RNA 病毒中一组独立进化的病毒转录抑制因子的鉴定

之前的研究中鉴定到几种不同植物病毒来源的多个病毒蛋白都可以靶向生长素响应转录因子，体外 LUC 报告实验显示（图 A-B），无论是双链 RNA 病毒、单链 RNA 病毒，都可以编码一类氨基酸序列没有相似性、但同样具有转录抑制活性的蛋白（RBSDV P8、SRBSDV SP8、RSV P2、RSMV M）。

图1：植物 RNA 病毒中一组独立进化的病毒转录抑制子的鉴定

2.SP8 与 OsMYC3 互作

为进一步研究上述转录抑制因子在病毒侵染过程中的功能，以 SRBSDV SP8 为例，利用酵母双杂交技术进行筛选，结果显示 SP8 可以与水稻 OsMYC3 蛋白相互作用，并且二者互作关系通过酵母一对一互作、BiFC、Co-IP、LCI 实验得以验证（图 A-C）。利用截短的 SP8 进行酵母一对一互作和 Co-IP 检测表明，与 OsMYC3 的结合依赖于 SP8 的 NTP 结构域（图 D-E）；同样，OsMYC3 的 TAD 结构域也是二者互作所必不可少的（图 F）。

酵母双杂交、BiFC 实验表明，OsMYC3 可以与 OsJAZ 相互作用。经茉莉酸处理，野生对照株根的长度明显被抑制、一系列 JA 生物合成和信号传导相关基因表达量上升，但 Osmyc3 突变体中抑制程度减轻、JA 相关基因表达量上升减少。

以上结果表明，OsMYC3 在 JA 信号通路中起着重要作用。

图2：SP8 与 OsMYC3 互作

3.SP8 抑制 OsMYC3 的转录激活以抑制 JA 信号

双荧光素酶报告实验表明，OsMYC3 可以直接结合到 OsJAZ4 启动子以激活其转录，但 SP8 会抑制 OsMYC3 对 OsJAZ4 的激活（图 A-B）。

过表达 SP8 的植株表现出轻微的发育迟缓，与 SRBSDV 症状相似；但在经过茉莉酸处理后，对照株根长度明显受到抑制，而过表达 SP8 的植株只有轻微抑制、JA 相关基因表达量上升程度减弱（图 C-D）。

图3：SP8 抑制 OsMYC3 的转录激活以抑制 JA 信号

4.SP8 干扰了 OsMED25 和 OsMYC3 的结合

之前的研究表明 MED25 可以与 MYC2 结合以调控基因转录。Co-IP、BiFC 实验显示，OsMED25 可以分别与 OsMYC3、SP8 结合（图 A-D），并且酵母一对一互作实验证实 OsMED25 同样与 OSMYC 的 TAD 结构域直接结合，暗示 OsMED25 和 SP8 可能竞争性结合到 OsMYC3。

BiFC、Co-IP 和 LCI 实验均显示，SP8 的存在会干扰 OsMED25 和 OsMYC3 的结合（图 D-G）。

图4：SP8 干扰了 OsMED25 和 OsMYC3 的结合

5.SP8 与 OsJAZ 协同抑制 JA 信号

已有研究表明 MYC 主要依赖与内源性 JAZ 抑制因子相互作用起到调控转录活性。酵母双杂交筛选、BiFC、Co-IP 实验显示，SP8 可以与多个 OsJAZ 蛋白结合，并且进一步的截短实验显示 SP8 的 C 末端是与 OsJAZ 结合所需的（图 A-D）。同样，BiFC 显示 SP8 的存在会干扰 OsMYC3 和 OsJAZ9 的结合。

双荧光素酶瞬时转录活性测定显示，OsJAZ 和 SP8 共表达可以显著抑制荧光信号的转录激活（图 E-F）。OsJAZs 对于 SP8 蛋白的累积无明显影响（图 G-H）。

以上结果表明，SP8 与 OsJAZ 协同抑制 OsMYC3 所介导的转录程序。

图5：SP8 与 OsJAZ 协同抑制 JA 信号

6.通过转录抑制因子调控 JA 途径是不同植物病毒中的一种保守策略

以上是以 SP8 为例进行的研究，接下来通过酵母双杂交、BiFC 实验对不同植物病毒蛋白和 JA 通路组分的相互作用进行了验证，结果显示，与 SP8 类似：RSV P2、RSMV M 蛋白可以抑制 OsMYC3 的转录活性，P2、M 可以与 OsMED25 相互作用，并且 P2、M 干扰了 OsMED25-OsMYC3 的互作以抑制转录。

以上结果表明，病毒蛋白干扰 OsMED25-OsMYC3 的互作以抑制 JA 信号在不同植物病毒侵染中是一种保守策略。

图6：通过转录抑制因子调控 JA 途径是不同植物病毒中的一种保守策略

7.OsMYC3 正向调控了针对 SRBSDV 和 RSV 的广谱抗病毒防御反应

接下来研究 JA 信号途径在病毒侵染中的作用：双链 RNA 病毒 SRBSDV 侵染后，与对照相比，OsMYC3 过表达植株体内病毒 RNA 和蛋白含量都相应降低（图 A-C），而 Osmyc3 突变体症状更严重（图 D-F）。单链 RNA 病毒 RSV 侵染结果与之类似。表明 OsMYC3 表现出对植物 RNA 病毒的广谱抗病毒防御作用。

图7：OsMYC3 正向调控水稻对 SRBSDV 的抗性

8.阻断 JA 信号促进介体昆虫的摄食

已有研究表明 JA 途径在植物应对昆虫取食中起着核心作用。结果显示，与 OsMYC3 过表达植株相比，Osmyc3 突变植株表现出对白背飞虱、灰飞虱更差的耐受性（图 A-B），并且介体昆虫的摄食增加（图 E）、体内病毒量上升；并且过表达 SP8 也显著提高了介体昆虫的摄食（图 G）。SRBSDV 和 RSV 感染同样会促进介体昆虫的摄食。

图8：阻断 JA 信号促进介体昆虫的摄食

研究结论

本研究报道了一类独立进化的的病毒转录抑制因子，它们可以劫持植物 JA 信号途径，通过靶向抑制茉莉酸信号途径中 OsJAZ-OsMYC3-OsMED25 这一关键功能模块，从而对 JA 信号转导起负调控作用，以利于病毒的感染和介体昆虫的摄食。

该研究为病毒致病性、媒介行为和宿主防御之间相互作用提供新的科研视角，并为虫传病毒病的防控及遗传改良作物抗病性提供广谱性的靶标和策略。

参考文献

Li L, Zhang H, Chen C, et al. A class of independently evolved transcriptional repressors in plant RNA viruses facilitates viral infection and vector feeding. PNAS 2021; 118(11): e2016673118.