2022-07-06 20:35:16, TIANGEN
核酸提取一上午,一测比值2.5
说起这科研路,真是一脸辛酸
我们都知道用OD260/OD280的值判断核酸纯度
可这坑爹的比值是咋来的?
纯DNA是1.8,纯RNA是2.0,谁规定的?
答案很简单:标准品测的
核酸、蛋白质在紫外光下有特定的吸收峰,核酸(包括DNA和RNA)的最大吸收值在260 nm左右,主要是由于嘌呤和嘧啶中的共轭双键造成。蛋白质的最大吸收峰在280 nm左右,绝大部分是由色氨酸和酪氨酸引起的。此外,230nm处的吸光值能反映乙醇、GTC、GuHCl、EDTA、多糖等的含量。用纯RNA的标准品进行吸光值测定,分别测得OD260和OD280处的吸光值,比值为2.0。同理,DNA的比值为1.8。
DNA的OD值要求及优化方法
在实际应用中,一般对于DNA来说,OD260/OD280在1.7-1.9之间即可满足绝大部分PCR检测实验需求。
当OD260/OD280>1.9时,有较大的概率是由于RNA残留导致OD260处吸光值升高,跑一个琼脂糖凝胶电泳一看便知。这个数值提示后续再进行DNA提取实验时,可以用RNase 进行消化,消除影响。
当OD260/OD280<1.7时,通常是由于蛋白残留造成的,通过琼脂糖凝胶电泳检测时,可观察到点样孔发亮。该状况常见于溶液沉淀法DNA提取。
RNA的OD值要求及质量优化
对于RNA来说,OD260/OD280在1.9-2.1之间,即可满足荧光定量PCR检测实验需求。
当OD260/OD280<1.9时,样本中存在蛋白质残留,常见于trizol法提取RNA时,主要是操作中吸入了中间层导致的。在进行此类实验时,吸取80%上清液即可,宁可少吸也不要吸到中间层。
当OD260/OD280>2.1时,RNA产生降解导致OD260处吸光值升高,通过琼脂糖凝胶电泳检测,可以看到泳道内弥散的条带。提示我们在RNA提取时应采用新鲜样品,在无RNase的实验环境下快速操作避免样本降解。您也可以尝试TIANGEN RNA Easy Fast系列RNA提取试剂盒,20 min内就能快速完成RNA提取。
值得注意的是,pH及盐离子对OD260/OD280值有一定影响,酸性溶液或水溶液比弱碱性缓冲液的OD260/OD280值低0.3-0.4。因此,核酸浓度及质量评估时,应注意核酸稀释液和洗脱液保持一致。
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如果核酸质量鉴定结果不佳
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