天美讲堂丨未知荧光样品测试小指南

2022-05-30 15:51:04, 天美天美仪拓实验室设备（上海）有限公司

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荧光光谱是一种广泛应用的分析技术，但测试未知样品荧光光谱即使对相对有经验的用户来讲也往往一种挑战。

下面是关于荧光光谱测量的步骤，是一篇新手友好型的操作小指南！面对未知样品，没有操作经验的伙伴儿们也能从容测试哦！

当测量未知样品的荧光时，首先最好先测量一下样品的吸光度。荧光与吸收光成正比，因此可以确定最大吸收波长。爱丁堡稳态瞬态荧光光谱仪FLS1000或FS5型号，均能够实现吸光度和荧光测试功能。在实际测试时，由于有些样品的激发光谱和发射光谱之间可能存在一些重叠。因此，通常可以选择一个比这个最大吸收波长位置更短的波长作为激发波长。

下面这个样品的实例是使用FS5 测试蒽环己烷溶液中的吸收光谱。最大吸收值大约为0.1, 通常为避免内滤效应（天美分析帖子中有讲过哦：荧光测试技巧之避免内滤效应）。我们将溶液浓度控制在0.1以下。在此基础上，可以将蒽环己烷溶液样品的激发波长设置为~355 nm或~375 nm。

在FS5上测试的蒽环己烷溶液的吸收光谱图

接下来，激发和发射波长可以进行调整，以最大限度地提高感兴趣的信号。同时可以调节激发和发射侧单色器狭缝，从而让更多的光通过。需要注意是，增加狭缝获取更高信号的同时，会降低光谱分辨率(即光谱线的分辨率)。测试时增加信号强度cps，以获得良好的信噪比，但应低于探测器饱和极限: 标准PMT检测器的饱和极限是150万cps。当单位时间内过多的光子照射至探测器时，将使测试数据失真，测试谱图扭曲；甚至有可能损坏检测器。

当测试条件优化好后，可以在光谱仪软件中进行测试参数的设置。爱丁堡光谱仪的测试窗口可以进行波长范围Scan range、步进step、停留时间Dwell time和重复次数Number of scans等参数。如下面测试窗口所示。停留时间（在每个测试步进点下的积分时间）和扫描次数对总采集时间有贡献。显然，更长的集成时间将提高数据的质量。同时，背景扣除和校正文件的选项也可以在对话框中进行勾选使用。