干货：细菌内毒素检查法的全套解决方案在这里！

提及内毒素检测很多人想到的都是 Charles River、Lonza、Hyglos、Combrex、湛江安度斯、厦门鲎试剂等这些厂家。其实这些厂家都或多或少的和BioTek Instruments, Inc.,有着各种密切的联系。BioTek生产的ELx808IU由于具有卓越的温度控制稳定性和精确性，专为内毒素检测设计定制的光源和滤光片系统，避免了光源信号衰减引起仪器检测值的波动，以其极高性价比成为全球各个内毒素检测试剂厂商的推荐选择，被誉为内毒素检测的金标准仪器。

这就是内毒素检测的金标准仪器ELx808IU的本尊，不是您眼花，也不是PS的图片，这是一客户实验室的真实照片。

金标准仪器就是大家都推荐的仪器，看看小伙们都是怎么做的:

Lonza 公司定制产品

Charles river 也是我们合作小伙伴之一

就是最严谨的德国人Hyglos 也是推荐我们的产品

在中国国内BioTek和湛江安度斯、厦门鲎试剂都有着多年的密切合作关系。

厦门鲎试剂定制的产品，为此还专门申请了医疗器械注册证、开发了专门针对我们产品的内毒素检测软件TALgent。

湛江安度斯生物有限公司定制的产品，还专门开发针对我们仪器的内毒素检测软件BioProbe。

相信群众的眼光，以上小伙伴的选择是不是可以给您的选择做一个不错的佐证。

美国伯腾仪器有限公司（BioTek）成立于1968年，总部位于美国Vermont，负责全球的销售、服务和区域支持。Biotek通过ISO9001/ISO13485认证，是FDA注册的医疗器械生产厂商，其产品通过欧盟IVD（In Vitro Diagnositic Directive）认证。BioTek还供IQ/OQ/PQ认证及FDA CFR21 PartⅡ tools，满足严格的质控要求。BioTek近50年来只专注于微孔板检测相关的仪器、软件，使之成为微孔板检测领域领军企业。

本文以中国药典2015版通则1143 细菌内毒素检查法为基础，阐述BioTek产品在细菌内毒素检测中的应用。

细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断样品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，2010年版中国药典收载的用细菌内毒素检查法来控制产品质量的品种已达506种，现行世界各国药典以及国际药典对此方法均有收载。鲎试剂被广泛应用于检测注射剂与植入性医疗器械中污染的革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以及临床使用的透析液和血液中的细菌内毒素含量

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。本文仅以光度测定法为基础结合BioTek公司的产品应用进行阐述。

本试验操作过程应严格防止内毒素的污染，所有使用的耗材必须除热原。加样的精确度和手法都本试验影响较大，推荐在超级工作台上进行操作，操作时应带口罩、手套，避免讲话。移液分液时避免产生气泡，气泡会影响时间的准确性。

为了避免热原和内毒素干扰，以及提高实验的准确性、重复性、便捷性，推荐使用BioTek的PrecisonXs移液分液工作站在超净工作台中处理样本。BioTek的PrecisonXs移液分液工作站可以根据不同的实验步骤，编辑标准曲线有效性实验、干扰实验、供试品检测实验的程序，自动化完成前期的实验准备工作。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。

细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌（E.coli）提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。

细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。

试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。

供试品溶液的制备  某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

内毒素限值的确定  药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：

L=K/M

公式中  L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；

K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；

M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。注射时间若不足1小时，按1小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量（M）。

按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。

确定最大有效稀释倍数（MVD）  最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数（1→MVD），在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：

MVD=cL/λ

式中  L为供试品的细菌内毒素限值；

c为供试品溶液的浓度，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml。如需计算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c=λ/L；

λ;为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。

光度测定法

光度测定法分为浊度法和显色基质法。

浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度或透光率所需的反应时间，或是检测浊度增加速度的方法。动态浊度法是目前市场上比较普遍的采用的方法。

显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色法。终点显色法是依据反应混合物中内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的呈色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的吸光度或透光率达到某一预先设定的检测值所需要的反应时间，或检测值增加速度的方法。目前国产比较成熟的是厦门鲎试剂实验厂有限公司和湛江安度斯生物有限公司生产的动态显色法试剂盒。

BioTek的仪器卓越的温控系统可以确保您按照下图进行全板加样，所有孔均能获得满意的结果。让您一次实验可以做更好的样品，减少实验次数，节省宝贵时间。

由于部分仪器的控温性能不佳（37℃±1℃），导致微孔板的边缘效应，部分试剂厂家推荐把周围的孔舍弃不用，采用下面的加样的模式，一次实验比上面的加样方法少做9个样品。

BioTek的Gen5软件可以根据实验的需求，预设各种检测参数：检测波长，检测温度、振荡时间、检测间隔。

Gen5也可以根据实验情况，实验前或实验后输入标准品浓度，供试品稀释度，供试品内毒素对照浓度等各种参数，再也不怕浓度、稀释度输入错误了，可以让您先放心的做实验、检测，然后在慢慢输入相关分析参数。即使是最关键的参数 Onset OD（预设启动OD值），如果在检测结束后，发现不合适，也可以根据实际情况进行修改，软件会根据新的数值自动更新分析结果，不用重新做一遍实验。

光度测定试验需在特定的仪器（推荐BioTek 的ELx808IU和 Epoch2 ）中进行，温度一般为37℃±0.5℃。精准的温度控制为内毒素检测试验成功的关键。

BioTek产品特有的4-Zone控温技术，可以保证仪器在整个检测过程中保持稳定状态。BioTek提供经过NIST认证的温度检测板进行3Q认证，该温度检测板模拟96孔微孔板，每个孔加200ul水放入检测仪中实时监测仪器内的温度并传回电脑，软件会自动分析仪器的温度精准性，确保符合实验要求。

如下图的微孔板四个边角和中间孔60分钟内的温度。

实时记录仪器检测室内不同位置的温度变化趋势

由于内毒素检测的灵敏度非常高，仪器轻微的波动，都可能对检测结果造成极大的干扰，仪器的稳定性是保证实验成功的另一个非常关键的因素。

BioTek提供的动力学噪音检测，可以检测到仪器任何轻微的波动，确保仪器处于稳定的工作状态，为实验保驾护航。

供试品和鲎试剂的加样量、供试品和鲎试剂的比例

以及保温时间等，参照所用仪器和试剂的有关说明进行。

为保证浊度和显色试验的有效性，应预先进行标准曲线的可靠性试验以及供试品的干扰试验。

标准曲线的可靠性试验  当使用新批号的鲎试剂或试验条件有任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。

用标准内毒素制成溶液，制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10倍），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。每一稀释步骤的混匀时间同凝胶法，每一浓度至少做3支平行管。同时要求做2支阴性对照，当阴性对照的吸光度或透光率小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。

跟据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。

上图为标准品和阴性对照的动态光度变化曲线图，软件自动给出每个标准品的Onset time，NC (2647Sec)> STD4 (2567Sec) ,符合实验要求。

Gen5 软件会自动根据预设的条件，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980，判断标准曲线是否有效，NC的启动时间是否大于标准品最小点的值。

干扰试验  选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λ_m），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表4制备溶液A、B、C和D。

表4  光度测定法干扰试验溶液的制备

注：A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。

B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知内毒素浓度的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。

C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。

D为阴性对照。

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量c_t和c_s，再按下式计算该试验条件下的回收率（R）。

R=(c_s-c_t)/λ_m×100%

当内毒素的回收率在50%～200%，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

软件自动计算所有样品的回收率是否在50%～200%之间，给出是否有效的判断。

当内毒素的回收率不在指定的范围内，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验来验证处理的有效性。

当鲎试剂、供试品的来源、处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。

检查法  按“光度测定法的干扰试验”中的操作步骤进行检测。

使用系列溶液C生成的标准曲线来计算溶液A的每一个平行管的内毒素浓度。

试验必须符合以下三个条件方为有效：

⑴ 系列溶液C的结果要符合“标准曲线的可靠性试验”中的要求；

⑵ 用溶液B中的内毒素浓度减去溶液A中的内毒素浓度后，计算出的内毒素的回收率要在50%～200%的范围内；

⑶ 阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。

结果判断  若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释倍数后，小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定。若大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。

判定条件：

1.标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。

2.阴性对照的检测值小于标准曲线最低点的检测值或反应时间大于标准曲线最低点的反应时间。

3.供试品复本之间的CV值小于10%（可选项，药典没有强制要求）

4.供试品回收率要在50%～200%的范围内

先看看实验结果是否有效：

1.标准曲线R=0.994，R>0.98,符合实验要求

2.NC无穷大，表示在实验结束时没有检测到NC的反应时间，大于标准曲线最低点的反应时间，符合实验要求

3.同一样品复本之间的CV值小于10%，软件判断 CV（SPL_ALL）<10有效 ,符合实验要求（对仪器和实验技能以及试剂要求非常高，不是国标强制要求）

4.所有样品的回收率要在50%～200%的范围内，软件判断50<SPLC_ALL>200有效,符合实验要求

实验完成后，可以根据自己的需求，定义需要的实验报告。

不用担心客户不知道您的实验条件，软件会自动记录您需要任何信息，方便您追溯实验过程：

也不用担心有人修改实验数据，如果您有任何的修改，软件一样会毫不客气的记录下来，不要想着隐瞒任何不好的数据，软件要真实的反应实验的过程。

上面的功能在科研生产上没有问题，如果用于临床检测，千万不要忘记一样东西，在中国要用于临床检测，注册证是必不可少的，否则会摊上大事的，我们可是有证的，可以放心用于临床检测，并出具临床检测报告。

Gen5  符合US FDA's 21 CFR part 11 电子签名认证，对用户权限分组、密码设定、数据追溯等都有详细的设定。所有软件和仪器的IQ/OQ/PQ/DQ都符合US FDA 和 ISO 9001/ISO 13485的要求，让您的实验在全球范围内获得认可。

有了这张证书，就不用担心您的小伙伴不承认您的数据了。

如果您除了内毒素检测还有更多需求应用，您可以选择我们其它款型号的仪器：

这一款 Epoch2，除了具有ELx808IU的全部功能外，还是一个全波长的微孔板分光光度计哦，不用担心没有您适合的滤光片，200nm到1000nm 任何选择，就是这么任性。

如果您还有更高需求，还需要荧光或发光检测，推荐您选择下面的型号，除了具有上面的所有功能，还可以让您开展 荧光强度、荧光偏振、时间分辨荧光、荧光共振能量转移、发光检测、甚至细胞培养、细胞成像都没有问题，其实它就是一个活细胞工作站。

如果您还有更多的需求，建议浏览我们的网站：www.biotek.com ,或者直接联系我们：

上海代表处

上海市浦东新区张江高科张衡路1299号凯信国际广场2号楼505室

电话：+86 21 50435800

邮件：infochina@biotek.com

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邮件：infochina@biotek.com

作者备注：

作者张传峰为BioTek中国区售后服务部经理，十多年来一直在为内毒素检测工作者提供技术咨询、实验指导，本文系作者多年经验总结，也是作者在实际工作中经常遇到问题的汇总，本文中引用的数据全部是真实的数据，如果引用的数据侵犯您的利益，请及时告诉作者，作者会第一时间删除。

特别感谢下面的老师的数据和图片以及各位合作伙伴给予支持：

1.中国食品药品检定研究院药理室蔡彤老师

 蔡老师给予本文大量的指导意见，并授权使用了部分数据和图片。

2.中国食品药品检定研究院药理室裴宇盛老师

 裴老师在本文编写过程中给予大量的指导意见，并授权使用了部分数据和图片。

3.山东省食品药品监督管理局魏霞老师

 魏老师和本文作者一起完成了大量的实验，提供宝贵的数据。

4.上海欧轩实业有限公司金鹏总经理

5.厦门鲎试剂实验厂有限公司吴尚毅总经理

6.湛江安度斯生物有限公司技术部熊向党经理

参考文献：

1.2015版中国药典通则1143 细菌内毒素检查法

2.药物分析杂志ChinJPharmAnal2014， 34（3）细菌内毒素检查新方法进展。 作者裴宇盛，蔡彤，高华 中国食品药品检定研究院，北京100050

3.Lonza Manual Limulus Amebocyte Lysate (Lal) Pyrogent&reg; -5000 Catalog Numbers: N383, N384, N588, N688

4.Charles River Manual of Limulus Amebocyte Lysate Endosafe &reg;KTA&trade; U.S. License No. 1197

5.厦门鲎试剂实验厂有限公司的动态浊度法内毒素检测鲎试剂盒使用说明书

6.湛江安度斯生物有限公司的动态浊度法（KTA）鲎试剂盒使用说明书2015年版10月第三版