生物多肽制品中氮含量的测定-全自动凯氏定氮仪 K-375/K-376，快速消解仪 K-439，尾气吸收仪 K-415

测定氮含量和蛋白质含量是药用多肽制品质量评价的一个重要指标。欧洲药典和美国药典均规定凯氏定氮法为重要的蛋白质含量测定方法，但对滴定法有不同的要求。欧洲药典规定采用以甲基红为指示剂的反滴定法，美国药典规定采用硼酸电位滴定法[1,2,3]。

介绍

本文旨在比较硼酸比色滴定、硼酸电位滴定和反滴定（电位）三种滴定方法，并检验三种方法的的重现性和准确度。以生物多肽注射液为样品，快速消解仪K-439进行消解，随后用全自动凯氏定氮仪K-375/K-376进行蒸馏和滴定。

图 1：全自动凯氏定氮仪K-375/K-376

图 2：快速消解仪K-439

图 3：尾气吸收仪K-415

实验

移液器吸取0.35mL样品（生物多肽注射液）到微型样品管中，加入5mL 浓硫酸和一片微型含钛催化剂。使用快速消解仪K-439进行消解。随后，使用全自动凯氏定氮仪K-375/K-376进行蒸馏和滴定。三种滴定模式的参数设置如表1-3所示。

表 1：进行硼酸电位滴定的蒸馏仪参数

蒸馏搅拌速度

5

传感器类型

电位

滴定类型

硼酸

终点pH

4.65

接收溶剂体积

50mL

滴定搅拌速度

7

滴定溶液

HCl   0.01mol/L

表 2：进行硼酸比色滴定的蒸馏仪参数

蒸馏搅拌速度

3

滴定溶液

HCl 0.01mol/L

滴定类型

硼酸

传感器类型

颜色

接收溶剂体积

60mL

滴定搅拌速度

10

表 3：进行反滴定的蒸馏仪参数

蒸馏搅拌速度

3

传感器类型

电位

滴定类型

反滴定

滴定溶液

NaOH0.01mol/L

接收溶剂

HCl 0.01mol/L

终点pH

5.6

接收溶剂体积

20mL

滴定搅拌速度

5

结果

硼酸比色滴定、硼酸电位滴定和反滴定（电位）三种滴定模式的测量结果如表4所示。每个样品重复测量3次(n=3)。

表 4：三种滴定模式下的测定结果

氮含量 [mg N/mL]

RSD (%)

硼酸滴定（电位）

6.24 ± 0.01

0.16

硼酸滴定（比色）

6.25 ± 0.01

0.23

反滴定（电位）

6.23 ± 0.04

0.58

三种滴定模式下，生物多肽注射液中的氮含量分别为6.24 ± 0.01 mg N/mL，6.25 ± 0.01 mg N/mL 和6.23 ± 0.04 mg N/mL。三种滴定模式下测得的结果相近且重现性均较好。

结论

由快速消解仪K-439、微型消化管、尾气吸收仪k-415、凯氏定氮仪K-375/K-376组成的全自动凯氏定氮系统完全符合欧洲药典和美国药典的实验标准，测定结果的重现性和准确度也能得到保证。

硼酸滴定和反滴定都是符合标准的凯氏定氮滴定法。应用凯氏定氮仪K-375/K-376进行硼酸滴定（比色/电位）和反滴定获得的结果相近。

关于欧洲药典和美国药典要求的具体讨论以及步琦实验室设备对于相关标准的适用性和契合性可参见应用文章No. 264/2016。除此之外，关于三种滴定模式的优劣势在该应用文章中也将进一步阐明[4]。

参考文献

[1] European Pharmacopoeia (01/2008:20509, 9th edition) 2.5.9., Determination of nitrogen by sulfuric acid digestion.

[2] European Pharmacopoeia (01/2008:20533, 9th edition) 2.5.33. Method 7, Total protein.

[3] Pharmacopoeia of the United States 461, Nitrogen determination (2016).

[4] Application note: 264/2016_Nitrogen determination in pharmaceutical active peptides. www.buchi.com/cn-zh

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