2022-04-29 18:29:25 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)
摘要
我们根据 FDA 指南开发并验证了人血浆 LC-MS/MS 测定,以确定 CYP2D6 抑制剂帕罗西汀对假定的特定 CYP2D6 底物育亨宾的药代动力学的影响。育亨宾、其主要代谢物 11-OH-育亨宾和帕罗西汀使用血浆 (100 mL) 用液-液萃取进行样品制备并进行定量。使用由乙酸铵 (5 mM)、乙酸和乙腈组成的梯度,使用 Phenomenex Luna C18 3 mm LC 色谱柱分离分析物。使用正电喷雾电离和选择性反应监测进行串联质谱检测,使用校准范围为 0.5 至 500 ng/mL的 13C 和氘标记的内标。定量下限 0.5 ng/mL 1 的准确度 <19%,相应的精密度 <16%。批次内和批次间准确度<14%,相应的精密度<12%。所有分析物的萃取回收率介于 75% 和 113% 之间。该测定法用于同时量化健康个体口服 5 mg 育亨宾和与 3 天摄入 20 mg 帕罗西汀组合后,育亨宾、其代谢物和帕罗西汀的血浆浓度。这使得研究育亨宾的药代动力学及其 CYP2D6 依赖性代谢与血浆暴露于 CYP2D6 抑制剂帕罗西汀的相关性成为可能,导致最大浓度翻倍,AUC 增加十倍,消除半衰期延长四倍。
关键词:育亨宾;帕罗西汀;CYP2D6;11-OH 育亨宾;LC-MS/MS;
+
样品信息
育亨宾;帕罗西汀;11-OH 育亨;
+
实验部分(仪器、试剂与材料)
1
主要仪器设备
API4000 QTRAP triple-stage quadrupole mass spectrometer (AB SCIEX)
2
试剂材料
乙腈、TBME、甲醇、异丙醇、乙酸、氢氧化钠都为质谱纯;Drug-free plasma;
3
样品净化
在塑料管 (10 mL) 中,向空白血浆 (100 μL) 中加入相应的工作溶液 (25 μL) 以制备校准和 QC 样品。将要测定的样品 (100 μL) 加入乙腈/水 (25 μL, 1 : 1, v/v) 以进行体积补偿。所有样品均加入内标溶液 (25 μL)。加入硼酸盐缓冲液 pH 9 (100 μL) 并涡旋。加入 TBME (2 mL) 并振摇 10 分钟。离心(10 分钟,3000 g)后,将 1.5 mL 有机相转移到试管中,并在氮气流下于 40°C 蒸发至干。将残余物在 LC 洗脱液(100 μL,乙腈/5 mM 乙酸铵;5 : 95 v/v,含 0.1% 乙酸)中复溶,涡旋振荡,超声处理,然后转移到带插入物的小瓶中。
4
LC-MS/MS色谱条件
色谱柱: Luna C18 column (150 *2.0 mm, particle size 3 mm, Phenomenex)
流动相A:0.5mM乙酸铵,0.1%乙酸,5%乙腈;
流动相B:0.01%乙酸乙腈溶液;
流速:250 μL/min;
柱温:40 ℃
进样量:20 µL
流动相梯度:见表1
表1 流动相梯度表
时间 (min) | A% | B% |
0 | 95 | 5 |
0.5 | 95 | 5 |
5 | 85 | 15 |
6.5 | 85 | 15 |
7 | 95 | 5 |
9 | 95 | 5 |
+
实验结果
图1 在 (A) 育亨宾前体离子 m/z 355 [M + H]+ 的正模式下使用电喷雾电离的产物离子扫描质谱,证明了生成的产物离子 m/z 144 [M + H]+, (B) 11 - OH 育亨宾母离子 m/z 371 [M + H]+ 和产生的产物离子 m/z 160 [M + H]+ 和 (C) 帕罗西汀母离子 m/z 330 [M +H]+ 子离子 m/z 192 [M + H]+
表2 人血浆中三种分析物的质量控制评估
图2 (A) 育亨宾 (5 mg) 和 (B) 11-OH-育亨宾的浓度-时间曲线,在健康参与者单独服用育亨宾和同时服用育亨宾和帕罗西汀 (20 mg) 后,口服给药后 30 分钟。
表3 在人类受试者中单独施用育亨宾
和与帕罗西汀同时施用后的药代动力学参数
结论:
✦
我们描述了一种新的、灵敏且准确的方法,用于测定育亨宾及其活性代谢物 11-OH 育亨宾与帕罗西汀的组合。据我们所知,这是第一个使用LC与 ESI MS/MS 系统耦合进行定量测定血浆中这三种分析物的测定法。即使在具有不同代谢状态的健康个体中,小样本量和宽校准范围也确保了良好的适用性。该方法被方便地应用于同时表征帕罗西汀对育亨宾药代动力学影响的差异,其表现出最大浓度翻倍,AUC增加十倍,育亨宾消除半衰期延长四倍,而代谢物仅显示最大浓度差异,表明育亨宾的主要代谢发生在肠道的首过阶段。
✦
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